Transferul de energie prin rezonanță de fluorescență (FRET) este un mecanism de transfer de energie care este utilizat pe scară largă în experimente biologice, cum ar fi examinarea structurii moleculare. Este adesea denumită „riglă spectroscopică”, datorită naturii sale în care distanța dintre doi fluorofori este determinată ca raportul dintre intensitățile fluorescenței.

fret

Credit: Micha Weber/Shutterstock.com

Aplicarea moleculelor biologice FRET este considerată inevitabilă, deoarece măsurătorile sale sunt extrem de sensibile la distanțe la scară nanometrică. Măsurarea FRET poate fi efectuată doar cu sensibilitatea unei singure molecule, deoarece se bazează pe tehnica de măsurare fluorescentă.

Aplicații ale FRET în detectarea hibridizării ADN-ului

Aplicarea FRET în hibridizarea sondelor ADN îmbunătățește hibridizarea în două aspecte.

  1. Semnalul de la sondele care nu au reacționat este stins când hibridizarea este efectuată pe baza FRET. Acest lucru evită nevoia de proceduri de spălare și suport solid atunci când reacția de hibridizare este observată în timp real ca o analiză omogenă. Avantajul acestui tip de test omogen este complexitatea și viteza mai reduse, astfel încât acesta poate fi ușor adaptat pentru performanțe automate.
  2. Hibridizările in vivo pot fi efectuate direct în celulele vii prin detectarea numai a semnalelor sondei care sunt hibridizate și datorită vitezei crescute de hibridizare în soluție. Au fost dezvoltate sonde de hibridizare FRET de diferite formate.

Aplicații ale FRET în detectarea mutației ADN

Sistemele de transfer de energie pot fi create (teste TDI) sau întrerupte (teste invadatoare) de către sondele FRET oligonucleotidice care au fost dezvoltate special pentru detectarea mutației ADN-ului. Testele invadatoare folosesc sonde degradabile, cum ar fi testele de 5 ’nuclează; în plus, ei folosesc două sonde degradabile, mai degrabă decât una și una nedegradabilă, care lucrează împreună.

Atât oligonucleotidele liniare, cât și cele în formă de ac de păr sunt folosite în dezvoltarea structurilor ADN ramificate și, în consecință, sunt distruse în timpul reacției. Celălalt avantaj al acestei abordări este că are ca rezultat o amplificare eficientă a semnalului și nu necesită PCR pentru a detecta foarte puține secvențe țintă. Avantajul distinct al testelor TDI este că sondele FRET sunt produse în procesul de detectare, dar necesită amplificare PCR.

Aplicarea FRET în studiile proteice

Interacțiunea cu proteina suprafeței celulare joacă un rol vital în procesul de semnalizare transmembranară. Rezultatele finale semnificative ale interacțiunilor receptorilor ligand sunt gruparea receptorilor și schimbarea conformației acestora. FRET este utilizat ca instrument pentru identificarea relației la distanță și a organizării supramoleculare a moleculelor de suprafață celulară. În dinamica proteinelor, plierea proteinelor este cel mai semnificativ proces care este investigat pe scară largă. smFRET a fost utilizat pentru a afla mai multe despre dinamica de tranziție a pliurilor și desfășurării moleculelor multi-domeniu cu două stări și mai mari.

Aplicarea FRET în cartografierea membranelor biologice

Interacțiunea proteinelor care este prezentă pe suprafața celulei este în esență importantă pentru procesul de semnalizare transmembranară. Gruparea receptorilor și variațiile conformațiilor acestora sunt factorii cheie care afectează rezultatul final al interacțiunii receptorilor ligand. Organizarea supramoleculară a suprafeței celulare și determinarea relațiilor la distanță pot fi efectuate eficient de FRET.

Aplicarea FRET în cartografierea membranelor biologice a avut ca rezultat gruparea receptorilor de lectină, distribuția suprafeței celulare a receptorilor tirozin kinaze și grupuri hematopoietice ale moleculelor de diferențiere și variații conformaționale ale moleculelor majore ale complexului de histocompatibilitate I privind legarea ligandului și modificarea potențialului membranei.

Aplicații în biologia celulară

Imagistica FRET care utilizează mutantul spectral GFP adaugă capacitatea de a monitoriza și localiza legarea ionilor și interacțiunile proteină - proteină în celulele vii. Proteinele semnificative ale receptorilor transmembranari care sunt implicate în aderență și semnalizare celulară sunt adesea cunoscute sub numele de integrină.

De exemplu, sunt detectate interacțiuni explicite in-vivo ale integrinei intermoleculare, care este activată prin microscopie FRET care este alcătuită dintr-o pereche de FRET CFP/YFP. Cuplajul local Rac - efector este indus prin ghidarea Rac către membrane și detașarea acestuia de Rho-GDI.

Mai mult, datorită dispersiei sale omogene în celulă, Rac este constitutiv activ; interacționează selectiv cu efectorii din anumite zone ale marginii celulei. Originea și terminarea semnalizării Ca2 + în secțiuni celulare specifice, cum ar fi reticulul endoplasmatic, nucleul sau citoplasma, pot fi observate prin calcularea modificării raportului în intensitatea fluorescenței donorului și a moleculelor acceptoare prezente în celulele vii.

Aplicații FRET în alte biomolecule

S-a crezut că reacțiile enzimatice conduse de dinamică sunt conformaționale. O enzimă dintr-o structură deschisă ar trebui să aștepte un substrat și să o catalizeze într-o structură închisă. Apoi, reacția progresează în continuare între molecule într-un mod asincron.

Aceasta implică faptul că adenilat kinaza (AK) a fost în echilibru între structura închisă și cea deschisă în ciuda naturii legării substratului, care modifică doar ratele de tranziție. Spre deosebire de cristalografia RMN sau de raze X, abordările standard pentru determinarea structurii biomoleculare, măsurarea smFRET nu are nevoie de moleculă pentru a atinge o structură de ordin superior.