articol de cercetare

  • Articol complet
  • Cifre și date
  • Referințe
  • Citații
  • Valori
  • Licențierea
  • Reimprimări și permisiuni
  • PDF

ABSTRACT

Introducere

Capacitatea de a percepe amărăciunea PROP este o trăsătură ereditară, iar gena asociată cu percepția amară a PROP este TAS2R38 [7]. Trei izoforme alelice comune ale genei TAS2R38 identifică sub-degustători (PAV/PAV), degustători (PAV/AVI) și subiecți non-degustători (AVI/AVI) și prima variantă a site-ului (P49A) explică o mare parte a variației fenotipice în PROP percepție [7-10]. Cu toate acestea, mai multe date au demonstrat că polimorfismele genei TAS2R38 explică doar parțial varianța percepției amare la care pot contribui alți factori non-genetici [11, 12].

rolului

În ultimul deceniu, a devenit evident că receptorii gustativi sunt exprimați nu numai în papilele gustative ale suprafeței limbii, ci și în organele gustative suplimentare (cum ar fi: sistemele digestive, respiratorii, genito-urinare, inima, creierul, tiroida, pielea, placenta și celule imune) sugerând că diferite tipuri de celule, în afara cavității bucale, pot utiliza receptori ai gustului [13-15]. Rolul exact al TAS2R38 în afara sistemelor gustative este încă evaziv.

Dovezile că indivizii obezi exprimă mai multe celule imunoreactive TAS2R38 în mucoasa colonică decât subiecții slabi [16] și că la șoareci administrarea intragastrică de substanțe chimice amare modifică aportul alimentar și greutatea corporală prin eliberarea de grelină [17], susțin ipoteza că receptorii gustativi ar putea fi implicat în reglarea secreției hormonilor apetitului, a echilibrului energetic și a reglării greutății corporale. Receptorii gustului dulce și amar sunt exprimați în adipocite de șoareci și afectează adipogeneza, chiar dacă într-o direcție care nu este încă clară [18-21]. Nu sunt disponibile date privind prezența și funcția ipotetică a TAS2R38 în țesutul adipos uman/adipocite.

Am investigat aici expresia TAS2R38 în țesutul adipos subcutanat (SAT) și visceral uman (TVA) de la indivizi obezi și cu greutate normală și relația sa cu variantele P49A. În plus, am evaluat in vitro efectul a doi agoniști amari diferiți asupra metabolismului lipidelor.

Materiale și metode

Probele de țesut adipos

Comitetul de etică al IRCCS Istituto Auxologico Italiano (Milano, Italia) a aprobat studiul (https://www.auxologico.it/ricerca-formazione/comitato-etico, codul CE de aprobare: 2017_05_16_08) și toți subiecții și-au dat consimțământul scris în cunoștință de cauză după o explicație completă a studiului. Am colectat biopsii de țesut adipos subcutanat (SAT) și visceral (TVA) de la un total de 50 de subiecți non-diabetici: 32 de subiecți obezi (20 de femei, 12 bărbați, cu vârsta de 45,1 ± 10,9 ani, IMC 43,1 ± 9,2 kg/m 2) care au fost supuși procedurilor chirurgicale bariatrice (cum ar fi gastrectomia mânecii, trecerea intestinală, benzile gastrice) și 18 persoane cu greutate normală (11 femei și 7 bărbați, cu vârsta de 43,5 ± 14,1 ani, IMC 24,2 ± 2,3 kg/m 2) fără infecții sau boli neoplazice supuse procedurilor de chirurgie plastică estetică.

Extracția ADN și ARN și sinteza ADNc

Din fiecare biopsie colectată, am izolat ADN și ARN. Biopsiile au fost omogenizate printr-o etapă de întrerupere mecanică folosind IKA T10 Ultra Turrax (IKA) cu o etapă de liză folosind margele Bashing de înaltă densitate conform instrucțiunilor producătorului (cercetare Zymo), apoi ADN-ul total a fost apoi extras cu ADN Blood & Trusa de țesuturi urmând instrucțiunile producătorului (Qiagen). ARN-ul a fost extras cu mini-kit RNeasy urmând instrucțiunile producătorului (Qiagen). Setul de DNază fără RNază (Qiagen) a fost utilizat pentru digestia posibilului ADN rezidual în timpul purificării ARN folosind mini-truse RNeasy pentru a garanta o îndepărtare completă a ADN-ului din probele de ARN. Cantitățile și calitatea ADN/ARN extras au fost evaluate prin spectrofotometru NanoDropH ND-1000 (NanoDrop Technologies). ADNc a fost obținut prin transcriere inversă a ARN extras de 500 ng, folosind kitul de sinteză SuperScript VILO cDNA și Master Mix (Life Technologies).

PCR cantitativ în timp real (RTqPCR)

TAS2R38, acidul gras sintază (FASN), receptorul gamma activat cu proliferatorul peroxizomului (PPARγ) și nivelurile de expresie genică ale transportorului de glucoză 4 (GLUT4) au fost evaluate începând de la 10 ng de ADNc utilizând sonde TaqMan (test la cerere, Applied Biosystems). Gena de menaj RPLP0 (proteina ribozomală LP0 umană) a fost utilizată pentru normalizarea datelor datorită stabilității ridicate a expresiei. Datele au fost analizate cu software-ul SDS V.3 (Software Diversified Systems) și cuantificarea relativă, exprimată ca unități arbitrare (AU), a fost calculată folosind metoda 2 ^ -ΔΔCt.

Extracția proteinelor și Western blot

Genotiparea TAS2R38

Culturi de celule in vitro

analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul SPSS (IBM Corp. Lansat 2017. IBM SPSS Statistics for Windows, Versiunea 25.0. Armonk, NY: IBM Corp) și GraphPad Prism. Datele sunt exprimate ca medie ± eroare standard (SE). Mijloacele au fost comparate cu ANOVA unidirecțională. Frecvențele variantelor genei P49A ale TAS2R38 au fost comparate utilizând testul χ-pătrat. Comparații multiple de grup au fost făcute folosind ANOVA unidirecțională, ANOVA bidirecțională sau ANOVA de măsură repetată bidirecțională (RM) urmată de testul post-hoc Bonferroni, după caz. O valoare p a Extinderii rolului receptorului gustului amar în țesuturile orale suplimentare: TAS2R38 este exprimat în adipocite umane

Publicat online:

Figura 1. Expresia genei mARN TAS2R38 în țesutul adipos întreg subcutanat (SAT) și visceral (TVA) al subiecților slabi (bare negre) față de pacienții obezi (bare albe) (panoul a, OB-SAT vs. NW-SAT, ** p Figura 1. Expresia genei mARN TAS2R38 în țesutul adipos întreg subcutanat (SAT) și visceral (TVA) al subiecților slabi (bare negre) față de pacienții obezi (bare albe) (panoul a, OB-SAT vs. NW-SAT, ** p Extinderea rolului receptorului gustului amar în țesuturile orale suplimentare: TAS2R38 este exprimat în adipocite umane

Publicat online:

Figura 2. (a) Analiza polimorfismului de lungime a fragmentului de restricție (RFLP) a genei TAS pentru P49A SNP. Nedigerate (U) și HaeIII benzile (D) digerate sunt prezentate într-un gel de agaroză de 4%. Sunt indicate fragmentele de ADN de 221 bp, 177 bp și 44 bp. În prima și ultima linie de gel, s-a încărcat scara de 100 bp-ADN. (b) Expresia genei TAS2R38 prin RTqPCR în biopsii obeze SAT și TVA prin variante genice P49A-TAS2R38: super degustător (TT), cheie (Tt) și non-cheie (tt). Expresia genică este raportată ca unități arbitrare (AU) după normalizare cu expresia RPLP0, NS)

Figura 2. (a) Analiza polimorfismului de lungime a fragmentului de restricție (RFLP) a genei TAS pentru P49A SNP. Nedigerate (U) și HaeIII benzile (D) digerate sunt prezentate într-un gel de agaroză de 4%. Sunt indicate fragmentele de ADN de 221 bp, 177 bp și 44 bp. În prima și ultima linie de gel, s-a încărcat scara de 100 bp-ADN. (b) Expresia genei TAS2R38 prin RTqPCR în biopsii obeze SAT și TVA prin variante genice P49A-TAS2R38: super degustător (TT), cheie (Tt) și non-cheie (tt). Expresia genică este raportată ca unități arbitrare (AU) după normalizare cu expresia RPLP0, NS)

Efectul agoniștilor gustului amar asupra biologiei adipocitelor

in vitro adipocitele diferențiate au fost stimulate cu trei concentrații diferite de PROP, chinină și cofeină (utilizate ca control al delipidării) timp de 4 ore (stimul acut). Toți compușii au indus o delipidare intracelulară semnificativă în comparație cu celulele netratate respective, cu un efect mai mare în adipocitele derivate din SAT (p Extinderea rolului receptorului gustului amar în țesuturile orale suplimentare: TAS2R38 este exprimat în adipocitele umane

Publicat online:

Figura 3. Delipidare (exprimată ca% din unități de fluorescență arbitrare, AFU) în in vitro adipocite diferențiate de țesutul adipos subcutanat (SAT, bare negre) și visceral (TVA, bare albe) după stimulare cu trei concentrații diferite de PROP, chinină și cofeină (utilizate ca control al delipidării). * p Figura 3. Delipidare (exprimată ca% din unități de fluorescență arbitrare, AFU) în in vitro adipocite diferențiate de țesutul adipos subcutanat (SAT, bare negre) și visceral (TVA, bare albe) după stimulare cu trei concentrații diferite de PROP, chinină și cofeină (utilizate ca control al delipidării). * p Extinderea rolului receptorului gustului amar în țesuturile orale suplimentare: TAS2R38 este exprimat în adipocite umane

Publicat online:

Supraexprimarea TAS2R38 la adipocitele subiecților obezi susține în continuare rolul biologic al receptorilor gustativi în țesutul adipos uman. Această supraexpresie poate fi o consecință a hipertrofiei adipocitelor care apare în urma expansiunii țesutului adipos sau reprezintă un nou mecanism de reglare. La șoarecii obezi induși de dietă, administrarea orală a unui ligand al receptorului gust amar scade greutatea, masa grasă, markerii inflamatori, creșterea cheltuielilor de energie și îmbunătățește toleranța la glucoză, sensibilitatea la insulină și profilul lipidic [33]. Aceste beneficii au fost atribuite stimulării eliberării GLP-1 de către celulele entero-endocrine; cu toate acestea, am putea ipoteza acum că modificările metabolismului adipocitelor ar fi putut contribui la efectele benefice ale agoniștilor gustului amar. Receptorii gustului amar al țesutului adipos pot fi, de asemenea, implicați în beneficiile induse de substanțele pe bază de plante amare folosite de secole în medicina tradițională chineză pentru tratarea bolilor metabolice, de focar și digestive [34].

În concluzie, receptorii gustului amar TAS2R38 sunt supraexprimați în adipocitele indivizilor obezi și implicați în metabolismul adipocitelor. Această constatare deschide un nou domeniu interesant în cercetarea obezității. Cercetări suplimentare privind activitatea lipazei sensibile la hormoni și reglarea căilor de absorbție a acizilor grași liberi/glucoză de către agoniștii amari vor ajuta la înțelegerea faptului că stimularea receptorilor gustativi poate fi o strategie terapeutică de control al acumulării de lipide în adipocite.

Mulțumiri

Autorii îi mulțumesc prof. Ella Pagliarini și Dr. Cristina Proserpio (Departamentul de Științe Alimentare, de Mediu și Nutriționale (DeFENS), Universitatea din Milano, Milano, Italia) pentru furnizarea de PROP, chinină și cofeină utilizate pentru in vitro stimulare.