Bayissi Bading-Taika

un Departament de Științe Clinice și Farmaceutice, Școala de Științe ale Vieții și Medicale, Universitatea din Hertfordshire, Marea Britanie

iboga

b Institutul de Farmacopee și Medicină Tradițională (IPHAMETRA), Libreville, Gabon

Tunde Akinyeke

c Departamentul de Neuroștiințe Comportamentale, Oregon Health & Science University, Portland, OR 97239, SUA

Armando Alcazar Magana

d Departamentul de Chimie, Universitatea de Stat din Oregon, Corvallis, OR 97331, SUA

și Institutul Linus Pauling, Universitatea de Stat din Oregon, Corvallis, OR 97331, SUA

Jaewoo Choi

și Linus Pauling Institute, Universitatea de Stat din Oregon, Corvallis, OR 97331, SUA

Michael Ouanesisouk

și Institutul Linus Pauling, Universitatea de Stat din Oregon, Corvallis, OR 97331, SUA

Eileen Ruth Samson Torres

c Departamentul de Neuroștiințe Comportamentale, Oregon Health & Science University, Portland, OR 97239, SUA

Lisa A. Lione

un Departament de Științe Clinice și Farmaceutice, Școala de Științe ale Vieții și Medicale, Universitatea din Hertfordshire, Marea Britanie

Claudia S. Maier

d Departamentul de Chimie, Universitatea de Stat din Oregon, Corvallis, OR 97331, SUA

Gerd Bobe

f Departamentul de științe animale și Rangeland, Universitatea de Stat din Oregon, Corvallis, OR 97331, SUA

Jacob Raber

c Departamentul de Neuroștiințe Comportamentale, Oregon Health & Science University, Portland, OR 97239, SUA

g Departamentul de Științe Farmaceutice, Universitatea de Stat din Oregon, Corvallis, OR 97331, SUA

h Departamentele de Neurologie și Medicină Radiologică, Divizia de Neuroștiințe, ONPRC, Oregon Health & Science University, Portland, OR 97239, SUA

Cristobal L. Miranda

și Institutul Linus Pauling, Universitatea de Stat din Oregon, Corvallis, OR 97331, SUA

g Departamentul de Științe Farmaceutice, Universitatea de Stat din Oregon, Corvallis, OR 97331, SUA

Jan F. Stevens

și Institutul Linus Pauling, Universitatea de Stat din Oregon, Corvallis, OR 97331, SUA

g Departamentul de Științe Farmaceutice, Universitatea de Stat din Oregon, Corvallis, OR 97331, SUA

Abstract

1. Introducere

În medicina tradițională, T. iboga, a fost mult timp utilizat sub formă de scoarță de rădăcină uscată la aer sau de coajă de rădăcină macerată (Goutarel și colab., 1993). Indigenii din Gabon ingeră preparate din scoarța rădăcinii acestei plante în timpul ritualurilor religioase pentru proprietățile sale psihoactive. Preparatele de iboga sau principalul alcaloid, ibogaina, sunt utilizate în prezent și pentru tratarea dependenței de droguri (morfină, heroină, metadonă și oxicontină) și simptome de sevraj la opiacee (Alper și colab., 1999). Mecanismul principal de acțiune al ibogainei pare să fie capacitatea sa de a se lega de mai multe situri de legare din sistemul nervos central (SNC), cum ar fi N-metil-D-aspartat (NMDA), canale ionice cuplate cu receptorii, κ-opioid și κ2 ), μ-opioid și σ2, serotonină (5-HT2 și 5-HT3), receptori muscarinici (M1 și M2), receptori monoaminooxidazici și receptori nicotinici de acetilcolină (Maciulaitis și colab., 2008). Ibogaina activează calea factorului neurotrofic derivat din linia celulară glială (GDNF) în zona segmentului ventral al creierului (Maciulaitis și colab., 2008).

Obiectivul general al acestui studiu a fost de a determina dacă administrarea dietetică a extractelor de T. iboga poate atenua hiperglicemia la șoarecii masculi C57BL/6J, un model de șoarece care dezvoltă obezitate, hiperglicemie și intoleranță la glucoză/rezistență la insulină atunci când este hrănit cu HFD (Miranda și colab. ., 2016). Folosind acest model de șoarece obez indus de HFD, am arătat anterior că tratamentul oral cu xanthohumol, un flavonoid de hamei, timp de 12 săptămâni atenuează creșterea în greutate și scade nivelurile plasmatice de glucoză în jeun, trigliceride totale, insulină, leptină, IL-6 și scăzută -densitatea colesterolului lipoproteic (LDL-C) într-o manieră dependentă de doză (Miranda și colab., 2016). De asemenea, am investigat efectele hrănirii extractului de iboga asupra performanței cognitive în labirintul de apă.

2. Proiectare și metode experimentale

2.1. Prepararea extractului de iboga

Coaja de rădăcină a T. iboga a fost furnizată de Institutul de Farmacopee și Medicină Tradițională (IPHAMETRA) din Libreville, Gabon. Extractul de iboga pentru studiul hrănirii șoarecilor a fost preparat prin metoda lui Sadoon și colab. (2014). Pe scurt, așchii de coajă de rădăcină au fost măcinați folosind un râșniță de cafea pentru a obține o pulbere fină. Pulberea (50 g) a fost macerată în apă cu agitare magnetică timp de 24 ore la temperatura camerei. Suspensia a fost filtrată și reziduul a fost clătit de două ori cu apă. Extractul de apă a fost ajustat la pH 9 cu hidroxid de amoniu și apoi extras de cinci ori cu cloroform în hota de fum. S-a adăugat sulfat de sodiu anhidru la extractele combinate de cloroform și stratul de cloroform a fost filtrat înainte de uscare sub vid folosind un evaporator rotativ pentru a obține 4 g de reziduu uscat. Reziduul (extract de iboga) a fost caracterizat prin cromatografie lichidă în combinație cu spectrometrie de masă (LC-MS/MS), utilizând facilitățile Centrului de spectrometrie de masă de la Universitatea de Stat din Oregon și utilizat pentru pregătirea dietei fortificate cu iboga.

2.2. Măsurarea concentrației de ibogaină în scoarța de iboga prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă tandem (LC-MS/MS)

2.3. Detectarea LC-MS a altor fitochimicale din T. iboga scoarță de rădăcină

2.4. Analiza calitativă a extractului de iboga

Pentru analiza calitativă (nemarcată), datele LC-MS/MS au fost achiziționate pe sistemul AB Sciex Triple TOF 5600 utilizând aceeași separare cromatografică. Pentru a detecta alcaloizii ca specii moleculare protonate, achiziția MS a fost efectuată în modul de ionizare pozitivă. Datele brute au fost procesate utilizând software-ul Progenesis QI (NonLinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, Marea Britanie). Progenesis QI este un instrument bioinformatic pentru descoperirea și analiza moleculelor mici. Au fost colectate peste 6.300 de spectre de masă brute. Metaboliții au fost atribuiți prin interogare extinsă și compararea caracteristicilor moleculare, și anume masa exactă (m/z), modelul de fragmentare MS/MS și similaritatea izotopică, împotriva Metlin ™ MS/MS, HMDB (Wishart și colab., 2018), KEGG și Bazele de date KnapSack. În fluxul de lucru Progenesis QI, am considerat un scor de încredere mai mare de 50 suficient pentru atribuirea constituenților din extractul de iboga. Un scor mai mare de 50 pentru un compus supus este atins atunci când deviația masei exacte de la masa exactă este mai mică de 5 ppm combinată cu o asemănare a modelului izotopic> 90%.

2.5. Studii pe animale

Șoarecii masculi C57BL/6J, în vârstă de 8 săptămâni, au fost achiziționați de la Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, SUA și au fost menținuți pe un ciclu de întuneric/lumină de 12 ore și au hrănit o dietă obișnuită de șoareci. După 1 săptămână de aclimatizare, șoarecii au fost repartizați în mod aleatoriu în 4 grupuri de 12 animale, și anume: Grupa 1, control normal LFD; Grupa 2, control HFD; Grupa 3, HFD + doză mică de iboga (0,83 mg ibogaină/kg greutate corporală/zi); și grupul 4, HFD + doză mare de iboga (2,07 mg ibogaină/kg greutate corporală/zi). Fiecare șoarece a fost găzduit individual în cuști de plastic etichetate cu apă îmbuteliată de la robinet în recipiente de plastic și alimentate dietele lor ad libitum. Greutățile corporale au fost înregistrate săptămânal. Aportul alimentar a fost monitorizat zilnic în timpul studiului de hrănire de 10 săptămâni.

În timpul săptămânii a 4-a și a 9-a a studiului, a fost efectuat un test de toleranță la glucoză (GTT). Cinci șoareci C57BL/6J din fiecare grup de tratament au fost postite timp de 4 ore și li s-a administrat o injecție intraperitoneală (i.p.) de D-glucoză (2 g/kg greutate corporală). O picătură de sânge a fost colectată dintr-o înțepătură de coadă la 0, 30, 60, 90 și 120 de minute după injecția bolus de glucoză pentru măsurarea glucozei utilizând un sistem de monitorizare a glicemiei Johnson și Johnson One Touch® Ultra Blood Glucose. Un test de toleranță la insulină (ITT) a fost, de asemenea, efectuat la 9 săptămâni de la studiul de hrănire. Un alt set de cinci șoareci din fiecare grup de tratament au fost postite timp de 4 ore înainte de a li se administra i.p. doză de insulină (0,75 U/kg greutate corporală). Glicemia a fost determinată utilizând același protocol ca și testul de toleranță la glucoză.

La sfârșitul perioadei de hrănire de 10 săptămâni, toți șoarecii, după un post peste noapte, au fost eutanasiați prin inhalare de CO2 și sângele a fost colectat pentru biomarkeri finali ai sindromului metabolic, inclusiv diabetul. Plasma sanguină a fost analizată pentru detectarea insulinei, a leptinei și a markerilor inflamatori (MCP-1, IL-6, MMP-9 și I-CAM-1) folosind truse ELISA. Colesterolul plasmatic total și trigliceridele au fost analizate folosind kituri de reactiv colesterol Infinity ™ și respectiv kituri de reactiv triglicerid Infinity ™ (ThermoDMA, Louisville, CO). Glucoza plasmatică a fost analizată de Glucoza Autokit (Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, VA). Colesterolul cu lipoproteine ​​cu densitate scăzută plasmatică (LDL-C), colesterolul cu lipoproteine ​​cu densitate ridicată (HDL-C), AST și ALT au fost estimate prin kituri disponibile comercial (Bioo Scientific Corporation, Austin, TX).

2.6. Funcția cognitivă

Șoarecii HFD au fost testați cu trei zile înainte de sacrificiu pentru performanță cognitivă folosind labirintul de apă așa cum s-a descris anterior (Miranda și colab., 2018). Pe scurt, labirintul de apă a constat dintr-un bazin mare circular, umplut cu apă făcută opacă cu cretă albă și înconjurată de indicii spațiale. Șoarecii au fost instruiți să localizeze o platformă limpede (12 cm diametru) scufundată la 1 cm sub suprafața apei. În timpul încercărilor vizibile, această platformă țintă a fost marcată cu un steag vizibil. Fiecare studiu a constat în plasarea animalului la marginea bazinului și permis explorarea labirintului. Locațiile de scădere au fost rotite și locația platformei a fost mutată în diferite cadrane ale labirintului după încercările 2 și 8, astfel încât memoria procedurală să nu fie folosită pentru a găsi platforma. Încercările au durat 60 de secunde sau până când mouse-ul a localizat platforma și a rămas pe ea timp de 3 secunde. Dacă un animal nu a localizat platforma în decurs de 60 de secunde, experimentatorul a condus-o pe platformă. În timpul zilelor de încercare vizibile, șoarecii au suferit 2 studii, iar în zilele ascunse de probă, șoarecii au suferit 3 studii. Studiile din aceeași zi au fost separate printr-un interval de 10 minute.

După antrenament ascuns, șoarecii au fost testați pentru reținerea memoriei spațiale într-un studiu de probă, în timpul căruia platforma a fost scoasă complet din labirint. Pentru a se asigura că șoarecii au învățat sarcina, au fost testați în două studii suplimentare pentru a localiza o platformă care conține un steag vizibil în urma probei de probă.

Testele au fost înregistrate folosind software-ul Ethovision XT 7 (Noldus Information Technologies, Wageningen, Olanda). Pentru a evalua învățarea spațială și memoria, latența față de platformă și distanța cumulativă față de țintă au fost analizate pentru antrenament. Distanța cumulativă până la țintă a fost, de asemenea, evaluată în timpul studiilor de sondare. Pentru a se asigura că diferențele de performanță cognitivă nu s-au bazat pe diferențele de viteză de înot, a fost analizată viteza medie de înot în timpul fiecărui tip de test.

2.7. analize statistice

Datele au fost analizate utilizând software-ul SAS 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC) și GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA). Datele referitoare la greutatea corporală, consumul de alimente, GTT și ITT au fost analizate folosind un proiect ANOVA cu măsuri repetate în timp în PROC MIXED. Măsurile repetate la animale au fost modelate utilizând o structură de variație-covarianță autoregresivă de prim ordin (greutatea corporală și aportul de alimente) sau o structură de structură de varianță-covarianță nestructurată (date GTT și ITT. Valorile de bază au fost utilizate ca covariate liniare pentru greutatea corporală și furaje date privind aportul Datele ASC prezentate în Figura 1 au fost analizate folosind un ANOVA unidirecțional și un test de comparație multiplu post-hoc al lui Tukey. O valoare p Figura 2 prezintă cromatogramele standardului ibogaină și ibogainei din extractul de scoarță. 1,93% ibogaină (g/g). Suprafața cromatografică de vârf a ibogainei cuprindea 24,6% din suprafața totală a vârfurilor cromatografice atribuite alcaloizilor cunoscuți și necunoscuți pe baza defectului lor comun de masă. conținutul scoarței se ridică la 7,8%. Acest număr este mai mare decât 5-6% alcaloizi indolici din scoarța rădăcinii raportate de Delourme-Houdé (1946), Marion (1952) și Dewick (2002), dar mai mic decât alka conținutul de loid al rădăcinii de iboga sub formă de pulbere (7,2% ibogaină, 0,6% ibogamină) raportat de Mazoyer și colab. (2013). Doar șapte alcaloizi au fost raportați anterior pentru T. iboga (Tabelul 1), pe care i-am identificat prin abordarea noastră metabolomică a plantelor. În plus, am atribuit provizoriu alți 23 de alcaloizi raportați pentru alte specii de plante, inclusiv taxonii aparținând Apocynaceae (Tabelul 1).