Holly J. Garringer

Departamentul de patologie și medicină de laborator și Indiana Alzheimer Disease Center, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, Indiana, Statele Unite ale Americii,

nivelului

Jill Murrell

Departamentul de patologie și medicină de laborator și Indiana Alzheimer Disease Center, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, Indiana, Statele Unite ale Americii,

Neeraja Sammeta

Departamentul de patologie și medicină de laborator și Indiana Alzheimer Disease Center, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, Indiana, Statele Unite ale Americii,

Anita Gnezda

Departamentul de patologie și medicină de laborator și Indiana Alzheimer Disease Center, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, Indiana, Statele Unite ale Americii,

Bernardino Ghetti

Departamentul de patologie și medicină de laborator și Indiana Alzheimer Disease Center, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, Indiana, Statele Unite ale Americii,

Ruben Vidal

Departamentul de patologie și medicină de laborator și Indiana Alzheimer Disease Center, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, Indiana, Statele Unite ale Americii,

Conceput și proiectat experimentele: RV. Experimentele efectuate: HJG JM NS AG BG RV. Analiza datelor: HJG BG RV. Am scris lucrarea: RV HJG BG.

Date asociate

Abstract

Introducere

Hiperfosforilarea și trunchierea mediată de caspază a tau la restul de acid aspartic (Asp) 421 (Asp 421 sau D421, cea mai lungă izoformă tau umană) pare să joace un rol important în asamblarea tau în filamente [19], [20]. De fapt, mai multe studii in vitro și in vivo sugerează că activarea caspazei poate fi un eveniment timpuriu în formarea NFT [19] - [21]. Folosind imagistica multiphoton in vivo, s-a observat că depunerile fibrilare tau sunt consecința unui proces degenerativ celular marcat de activarea caspazei [22]. După formarea unui nou încurcătură în cadrul neuronului, celula a rămas vie și activitatea caspazei pare să fie suprimată. Important, formarea NFT și scindarea tau la aminoacidul Asp 421 pot fi declanșate de peptidele Aβ, care leagă amiloidul și tau [19].

Aici, am generat șoareci transgenici dubli (Tg-FDD-Tau) prin încrucișarea șoarecilor transgenici care exprimă mutantul danez BRI2 (Tg-FDD) uman cu șoareci care exprimă mutantul Tau-P301S (Tg-Tau) mutant uman pentru a studia in vivo relația între BRI2, ADan și tau. Studiile noastre oferă noi perspective in vivo asupra patogeniei FDD și o legătură mecanicistă între ADan, tau și patologia sinaptică.

Materiale și metode

Șoareci transgenici

Declarație de etică

Acest studiu a fost realizat în strictă conformitate cu liniile directoare pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator ale Institutelor Naționale de Sănătate. Protocolul a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Școala de Medicină a Universității Indiana (numărul protocolului: 10142). Toate intervențiile chirurgicale au fost efectuate sub anestezie și s-au depus toate eforturile pentru a reduce la minimum suferința animalelor.

Testarea rotarodului

Funcția motorie a șoarecilor WT C57BL/6 (n = 7), Tg-FDD (n = 10), Tg-Tau (n = 11) și Tg-FDD-Tau (n = 9) a fost testată la șase luni de vârstă folosind un dispozitiv rotarod (Columbus Instruments International, Columbus, OH) așa cum a fost descris anterior [26]. Au fost folosiți doar șoareci naivi. Fiecare proces a durat maximum 10 minute, timp în care tija rotativă a suferit o accelerație liniară de la 4 la 40 rpm în primele 5 minute ale procesului și apoi a rămas la viteza maximă pentru restul de 5 minute. Animalele au fost punctate pentru ca latența lor să scadă (în secunde) pentru fiecare proces. Animalele au fost odihnite minimum 30 de minute între încercări pentru a evita oboseala și epuizarea. Fiecare șoarece a efectuat patru încercări în fiecare din cele patru zile consecutive.

Anticorpi

Histologie și imunohistochimie

Șoarecii au fost anesteziați și perfuzia fixată cu 4% paraformaldehidă în tampon fosfat 0,1 M, pH 7,2 (Sigma-Aldrich). Creierele au fost îndepărtate, încorporate în parafină și secționate. Secțiunile (8 μm grosime) au fost tăiate și montate pe lamele acoperite cu poli-l-lizină și colorate cu hematoxilină și eozină [23], [26], [27]. Unele secțiuni au fost colorate cu colorare cu argint Bodian. ThS a fost utilizat pentru a arăta prezența depozitelor de amiloid în creier [23], [27]. Colorarea imunohistochimică a secțiunilor de șoareci a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [23], [27]. Numărul de celule a fost efectuat pe patru șoareci Tg-Tau și patru șoareci Tg-FDD-Tau la vârsta de 6 și 11 luni. Șoarecii individuali au fost codificați și, pentru fiecare animal, creierele au fost tăiate în serie în secțiuni coronare (6 μm grosime) și imunoclorați cu AT8 și Tau-C3 Abs. Numărul total de neuroni pozitivi de-a lungul neocortexului a fost estimat pe 11 secțiuni coronare la intervale de 180 µm, urmând un protocol standard [28]. Celulele nervoase au fost numărate manual folosind un obiectiv de 20 × sau 40 ×. Pentru a evita numărarea aceluiași neuron în secțiuni consecutive, au fost incluși doar neuronii cu nucleol. Analiza statistică a fost făcută folosind GraphPad Prism versiunea 5.04 (GraphPad Software, San Diego, CA).

Extracția proteinelor

Analiza Western blot

Concentrațiile de proteine ​​au fost determinate cu setul de testare a proteinelor BCA (Pierce). Patruzeci de g de proteine ​​din PNS și probe solubile în sarkosil au fost utilizate pentru analiza Western blot. Pentru analiza western blot au fost utilizate cinci mg de țesut g/v (greutatea pre-prelucrare a țesutului (mg)/200 ofl de tampon de probă) din fracțiunile insolubile sarkosil. Proteinele au fost separate pe geluri prefabricate Mini-Protean TGX (Bio-Rad), rulate în condiții de denaturare și electrotransferate la membrana Immobilon PVDF (Millipore). Membranele au fost blocate cu 0,01% lapte în PBS (10 mM fosfat, pH 7,4, 150 mM NaCI) cu 0,05% Tween-20 (PBS-T, toate de la Sigma) utilizând sistemul de detectare a proteinelor SNAP ID (Millipore) apoi incubat 2 ore sau peste noapte cu Ab primar. După spălări cu tampon PBS-T, membranele au fost incubate 1 oră cu Ab secundar conjugat HRP adecvat și vizualizate folosind kitul Pierce ECL Pico (Pierce). Pentru a asigura încărcarea egală a proteinelor probelor solubile și PNS, pete au fost sondate cu anti-β-actină. Bloturile au fost scanate și cuantificate utilizând software-ul Image J de la NIH. Analiza statistică a fost realizată folosind GraphPad Prism versiunea 5.04 (Software GraphPad).