Abstract

Pentru a examina rolul potențial al metabolismului BCAA în creșterile asociate obezității în BCAA plasmatice, am examinat concentrațiile complexe BCATm și/sau BCKD și starea de fosforilare BCKD E1α în mușchi, ficat și grăsime de la rozătoarele obeze. De asemenea, am examinat aceste enzime în țesutul adipos visceral și subcutanat de la oameni cu obezitate morbidă înainte și după o intervenție de slăbire, intervenție chirurgicală de bypass gastric. Rezultatele sunt în concordanță cu ipoteza că modificările metabolismului BCAA în ficat și țesutul adipos pot contribui la creșterea BCAA în obezitate.

obezitate

Animale și subiecți umani.

Toate experimentele pe animale au fost revizuite și aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Colegiul de Medicină al Universității de Stat din Pennsylvania și au respectat ghidurile Institutului Național de Sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor experimentale. Șoareci (COM)ob/ob, controlul slab și C57BL/6J) au fost achiziționate de la Jackson Laboratory. Șobolanii de control gras și slabi Zucker au fost cumpărați de la Charles River Laboratory. Animalele au fost adăpostite în unitatea pentru animale din Pennsylvania State College of Medicine, cu o temperatură ambiantă de 21-23 ° C pe un ciclu de lumină-întuneric 12: 12-h și li s-a oferit acces gratuit la apă și la o dietă de rozători (Harlan Teklad 2018; Madison, Wisconsin). Țesuturile au fost obținute de la animale hrănite liber sau postite peste noapte care au fost eutanasiate cu pentobarbital (100-150 mg/kg) și fixate între plăcile răcite la temperatura de azot lichid.

Probele anonime de țesut uman au fost obținute de la banca de țesuturi pentru obezitate a Departamentului de Sănătate din Pennsylvania. Recrutarea subiecților și funcționarea băncii de țesuturi este aprobată de Colegiul de Medicină Institutional Review Board. S-au obținut probe de plasmă și țesut adipos (subcutanat și omental) pentru subiecți bărbați și femei care au fost supuși unei intervenții chirurgicale de bypass gastric deschis pentru tratamentul obezității morbide. Consimțământul informat a fost obținut de la acești subiecți înainte de operație. Subiecții nu au fost ingerați nimic pe cale orală după miezul nopții cu o zi înainte de operație și colectarea țesuturilor. Au fost recoltate două probe de la fiecare subiect, unul la operația bariatrică inițială și celălalt, la un număr mai mic de subiecți, la o a doua procedură chirurgicală efectuată în medie 17 luni după prima intervenție chirurgicală. A doua intervenție chirurgicală a fost necesară din punct de vedere medical pentru repararea herniei, boala vezicii biliare sau îndepărtarea excesivă a pielii.

Testele activității enzimei BCAT și BCKD.

Analiza Western blot.

Proceduri analitice.

Concentrațiile plasmatice de BCAA au fost măsurate utilizând fie un test spectrofotometric enzimatic, așa cum este descris de Beckett (2), fie ca parte a unei determinări complete a aminoacizilor utilizând o metodă fluorometrică cuplată HPLC (57). Pentru analiza spectrofotometrică, leucina-dehidrogenază bacteriană (Toyobo, New York, NY) a fost utilizată pentru a cataliza oxidarea BCAA. Producția de NADH a fost măsurată la 340 nm folosind un spectrofotometru.

analize statistice.

Studiile inițiale au comparat stările nutriționale separat; adică datele hrănite și postite au fost inițial derivate din două pete separate în momente diferite. Cu toate acestea, unele diferențe în reglarea punctelor finale între stările hrănite și cele postite au făcut necesară reanalizarea probelor stocate împreună pe aceleași pete, acolo unde este posibil. Pentru a le compara împreună, probele rămase au fost electroforizate pe aceeași pată și reanalizate împreună; cu toate acestea, nu era suficient material pentru a relua toate ob/ob probe. În acest caz, datele originale sunt afișate pentru acele puncte finale și pentru un student cu două cozi t-testul a fost folosit pentru a compara doar stările slabe și obeze (P

FIG. 1.Efectul obezității asupra concentrațiilor plasmatice de aminoacizi cu lanț ramificat (BCAA). BCAA-urile plasmatice au fost măsurate utilizând testul spectrofotometric. A: concentrațiile plasmatice de BCAA plasmatice hrănite (hrănite) și peste noapte lipsite de alimente (postite) în vârstă de 13 săptămâni ob/ob șoarecii de control slab masculi și de vârstă hrăniți cu o dietă normală de chow (n = 8/grup). *P

tabelul 1. Greutatea corpului și a organelor și concentrația plasmatică a insulinei și a metaboliților la șoarecii slabi și ob/ob

Valorile sunt mijloace ± SE; n = 8/grup.

masa 2. Concentrațiile plasmatice de aminoacizi la șoareci slabi și ob/ob

Valorile sunt medii ± SE exprimate ca concentrații μM de aminoacizi; n = 8/grup.

* P † P ‡ P

Tabelul 3. Concentrațiile plasmatice ale α-cetoacizilor cu lanț ramificat

Valorile sunt medii ± SE exprimate ca concentrații μM; n = 8-10/grup.

* P

FIG. 2.Enzime catabolice BCAA și fosfo-Ser 293 (pS293) Imunoreactivitate E1α în mușchiul scheletic al ob/ob șoareci și șobolani Zucker. Mușchiul gastrocnemius a fost obținut de la hrănirea aleatorie sau peste noapte ob/ob șoareci și șobolani Zucker. Cantități egale de proteină de lizat muscular de la șoareci slabi (L) și obezi (O)A) sau șobolani Zucker slabi (L) și obezi „grași” (F)B) au fost apoi separate prin SDS-PAGE și transferate în difluorură de poliviniliden (PVDF). Aceste pete au fost testate pentru anticorpi împotriva aminoacidului aminotransferazei cu lanț ramificat mitocondrial (BCATm), a-cetoacidului dehidrogenază cu lanț ramificat (subunitatea BCKD E1α), BCKD fosforilat (pS293 E1α) și kinazei BCKD (fund banda este nespecifică). Tubulin a fost utilizat ca control de încărcare. Nu s-a găsit nicio diferență statistică în concentrația oricăruia dintre antigeni între starea slabă și obeză atunci când au fost analizate replicile (P > 0,05, n = 8; densitometria nu este prezentată).

BCATm nu este exprimat în ficatul rozătorului adult (23, 25), în timp ce ficatul conține cea mai mare concentrație de activitate a complexului BCKD și se crede că este principalul situs al oxidării α-cetoacizilor cu lanț ramificat (53). Pe o dietă standard de rozătoare, complexul BCKD hepatic este aproape 100% nefosforilat în stare activă și are o activitate scăzută a kinazei BCKD, adică subunitatea E1α Ser 293 este în mare parte nefosforilată (17, 19, 35). Ca și în mușchi, cantitățile de subunitate BCKD E1α au fost nealterate de obezitate în ob/ob șoareci comparativ cu controalele slabe (Fig. 3A). Cu toate acestea, expresia kinazei BCKD a fost crescută de două până la trei ori în timpul hrănirii sau peste noapte ob/ob șoareci comparativ cu controalele slabe (Fig. 3D). Creșterea expresiei kinazei a fost asociată cu o creștere de două până la trei ori a raportului dintre fosforilarea E1α-pS293 și E1α totală atât la ficății hrăniți, cât și la cei care au postit peste noapte din ob/ob în comparație cu șoarecii de control frați slabi (Fig. 3C). Am arătat anterior o corelație puternică între scăderea activității BCKD hepatice și imunoreactivitatea anticorpului pS293 la șobolani; cu toate acestea, nu am efectuat experimente similare la șoareci. Prin urmare, a fost examinată activitatea BCKD. Activitatea BCKD hepatică a fost deprimată la obezi ob/ob șoareci pe bază de grame de greutate tisulară sau de miligrame de proteine ​​(Tabelul 4).

FIG. 3.Imunoreactivitate kinazică BCKD E1α și BCKD kinază totală și pS293 în ficat din ob/ob șoareci. Lizatele proteice din ficat, fabricate din slab și congelat ob/ob pulberi de ficat de șoarece, au fost egalizate pentru conținutul de proteine, separate prin SDS-PAGE și transferate în PVDF pentru imunoblotare. A: imunobloti reprezentativi ai BCKD E1α total (ficatul nu exprimă BCATm), pS293 E1α, BCKD kinază. Western blot pentru β-actină a fost utilizat ca control de încărcare. Graficele arată analiza densitometrică a replicilor pentru BCKD E1α (B), raportul pS293 E1α/BCKD E1α (C), și BCKD kinaza (D). Datele alimentate și postate au fost inițial derivate din 2 pete separate în momente diferite. Pentru a le compara împreună, probele rămase au fost electroforizate pe aceeași pată și reanalizate împreună; cu toate acestea, nu a existat suficient material pentru a relua kinaza BCKD. Datele originale sunt afișate pentru acel punct final; A t-testul a fost folosit pentru a compara doar stările slabe și obeze (n = 6/grup). Celelalte probe reanalizate au fost comparate între starea slabă și obeză, precum și starea nutrițională utilizând un ANOVA, urmat de o comparație multiplă Student-Newman-Keuls după test. **P 0,05).

Tabelul 4. Activitatea BCKD la ficat de la șoareci de control slab și ob/ob în stare hrănită și postită

Activitățile actuale și totale se referă la activitatea cu α-cetoacid dehidrogenază cu lanț ramificat (BCKD) măsurată în extracte de țesut înainte (efectivă) și după defosforilare (total; datele nu sunt prezentate). Starea activității este raportul dintre activitatea reală și cea totală.

* P † P

FIG. 4.Imunoreactivitatea kinazei BCKD E1α și BCKD kinază fosforilată totală și pS293 în ficat de la șobolanii Zucker. Lizatele hepatice, realizate din slab și înghețat fa/fa pulberi grase de ficat de șobolan Zucker, au fost egalizate pentru conținutul de proteine, separate prin SDS-PAGE și transferate în PVDF. A: imunobloti reprezentativi ai BCKD E1α (ficatul nu exprimă BCATm), pS293 E1α, kinaza BCKD. Western blot pentru β-actină a fost utilizat ca control de încărcare. Graficele arată analiza densitometrică a petei pentru BCKD E1α (B), raportul pS293 E1α/BCKD E1α (C), și BCKD kinaza (D). Un ANOVA a fost folosit pentru prima dată pentru a compara stările slabe și obeze, precum și stările de hrănire și de post, urmate de o comparație multiplă Student-Newman-Keuls după test. *P 0,05).


FIG. 5.BCATm, total și pS293 fosforilat BCKD E1α și BCKD kinază imunoreactivitate în țesutul adipos din ob/ob șoareci. Cantități egale de lizat proteic, obținute din slab și obez congelat ob/ob șoareci pulberi de țesut adipos, au fost separate prin SDS-PAGE și transferate în PVDF. A: imunobloti reprezentativi ai BCATm, BCKD E1α total, pS293 E1α și kinază BCKD. Western blot pentru β-actină a fost utilizat ca control de încărcare. Graficele arată analiza densitometrică a BCATm (B), total BCKD E1α (C), imunoreactivitatea pS293 E1α ca raport la BCKD total (D) și BCKD E1α kinaza (E). Un ANOVA urmat de un test comparativ multiplu Student-Newman-Keuls a fost folosit pentru a compara stările slabe și obeze din stările de hrănire și de post (n = 6/grup). **P c P o P 0,05).


FIG. 6.Exprimarea BCATm, pS293 fosforilat și BCKD E1α total și imunoreactivitatea kinazei BCKD în țesutul adipos al șobolanilor Zucker. Cantități egale de proteine ​​lizate, obținute din pulberi de țesut adipos de șobolan Zucker slab și obez, au fost separate prin SDS-PAGE și transferate în PVDF. A: imunobloti reprezentativi ai BCATm, BCKD E1α total, pS293 E1α și kinază BCKD. Western blot pentru β-actină a fost utilizat ca control de încărcare. Graficele arată analiza densitometrică a BCATm (B), total BCKD E1α (C), imunoreactivitatea pS293 E1α ca raport la BCKD total (D) și BCKD E1α kinaza (E). Un ANOVA urmat de un test comparativ multiplu Student-Newman-Keuls a fost folosit pentru a compara stările slabe și grase din stările de hrănire și de post (n = 6/grup). *P f P 0,05).

Nu este clar ce contribuție relativă are țesutul adipos la metabolismul BCAA al întregului corp și cum se schimbă acest lucru în obezitate, unde țesutul adipos devine un factor mai important în greutatea corporală. Țesutul adipos conține activitate BCATm și BCKD (14, 16). După cum se arată prin Western blot, țesutul adipos are aproximativ de două ori mai mult BCATm pe miligram de proteină decât mușchiul și de aproximativ cinci ori mai multă subunitate BCKD E1α (36). Cantitatea de subunitate E1α a țesutului adipos este comparabilă cu cea din ficat (36). În Western blots, concentrațiile relative de proteină BCATm au fost mai mici în diferite preparate de hrană ob/ob țesut adipos de șoarece comparativ cu controalele slabe (Fig. 5, A și B), cea mai mică diferență fiind de aproximativ o reducere de 63%. Activitatea BCAT pe gram de țesut a fost cu 52% mai mică la obezi ob/ob șoareci (129 ± 6 nmol · min -1 -1 g țesut -1, n = 8) decât în ​​controalele slabe (266 ± 26 nmol · min −1 · g țesut −1, n = 6, P -1 -1 mg proteină -1) decât în ​​controalele slabe (19 ± 1 nmol · min -1 -1 mg mg proteină -1, n = 6, P

FIG. 7.Concentrațiile plasmatice de BCAA la subiecți umani obezi morbid la post-noapte înainte și după intervenția chirurgicală de bypass gastric. Plasma a fost colectată între orele 9:00 și 12:00 după un post peste noapte după inducerea anesteziei generale de la subiecții descriși în tabelul 4 înainte de intervenția chirurgicală de by-pass gastric Roux-en-Y și mai târziu când subiecții s-au întors pentru a doua intervenție chirurgicală. Plasma a fost depozitată la -80 ° C până când a fost efectuată analiza pentru concentrația totală de BCAA așa cum este descris în Fig. 1 folosind un test enzimatic. **P


FIG. 8.Expresia proteinei țesutului adipos subcutanat și visceral înainte și după pierderea în greutate indusă de chirurgia bariatrică. Țesutul adipos subcutanat și visceral (omental) abdominal a fost colectat longitudinal de la subiecții descriși în Tabelul 5. Țesutul adipos prins cu îngheț a fost pulverizat sub azot lichid. Infranatanții lizaților preparați din aceștia în condiții de conservare a stării de fosforilare au fost solubilizați cu tampon de probă SDS-PAGE, separat prin electroforeză cu gel SDS și transferați în PVDF. A: imunobloti reprezentativi ai BCATm, BCKD E1α total, pS293 E1α și kinază BCKD. Western blot pentru β-actină a fost utilizat ca control de încărcare. Graficele arată analiza densitometrică a BCATm (B), total BCKD E1α (C), imunoreactivitatea pS293 E1α ca raport la BCKD total (D) și BCKD E1α kinaza (E). O bară verticală separă graficele de bare pentru depozitele subcutanate și viscerale, deoarece acele pete nu au fost rulate pe aceleași geluri, transferate în aceeași cutie sau neapărat expuse cu același lot de reactiv ECL. Astfel, comparațiile sunt limitate la probele înainte și după intervenția chirurgicală de bypass gastric; A t-testul a fost utilizat pentru a determina semnificația. *P 0,05 în ambele cazuri).

Operația bariatrică la subiecții umani cu obezitate morbidă a condus la o pierdere în greutate de aproximativ 56 kg în decursul a ~ 17 luni (Tabelul 5), atât la subiecții de sex masculin, cât și la cei de sex feminin. Pierderea medie în greutate, glucoza plasmatică și nivelurile de insulină nu au fost semnificativ diferite între subiecții bărbați și femei la momentul celei de-a doua operații (Tabelul 5). Deoarece nu au existat diferențe evidente la bărbați și femei în ceea ce privește acești parametri, precum și enzimele metabolizante BCAA sau BCAA plasmatice, aceste date au fost reunite. Cu toate acestea, din cauza numărului de probe de țesut implicate, nu a fost posibil să se compare în mod direct visceral și subcutanat în condițiile anterioare și ulterioare. Prin urmare, fiecare depozit a fost evaluat separat, înainte și după operație, folosind un t-Test.

Tabelul 5. Caracteristicile subiecților umani care furnizează țesut adipos visceral și subcutanat înainte și după intervenția chirurgicală de by-pass gastric Roux-en-Y

Valorile sunt medii ± SE. HOMA-IR, indicele de rezistență la insulină.