Abstract

Introducere

Sinapsele chimice constau dintr-un terminal presinaptic, o fisură sinaptică și o specializare postsinaptică. Zona activă presinaptică, prin care sunt eliberați neurotransmițători, acumulează un set distinct de proteine ​​(Zhai și Bellen, 2004). În timpul diferențierii presinaptice, aceste proteine ​​sunt livrate printr-un transport pe bază de vezicule și sunt asamblate la locurile sinaptice născute pentru a forma o nanostructură organizată (Jin și Garner, 2008). Mecanismele moleculare ale modului în care este inițiată și reglată asamblarea componentelor presinaptice rămân necunoscute.

omologiei

Proteinele familiei Liprin-α sunt proteine ​​pentru schele (Spangler și Hoogenraad, 2007). Jumătățile N-terminale ale proteinelor sunt bogate în spirale și conțin două segmente extrem de conservate numite „regiunile de omologie Liprin-α 1 (LH1) și 2 (LH2)” (Schoch și colab., 2002). Jumătățile C-terminale conțin trei domenii conservate de steril-α-motiv (SAM), adesea denumite LHD (pentru domeniul omologiei liprinului), care leagă proteina receptor de tip LAR tirozin fosfatază (Serra-Pagès și colab., 1998). N-terminalul Liprin-α poate lega mai multe proteine, inclusiv RIM (Schoch și colab., 2002) și ELKS/ERC/CAST (Ko și colab., 2003), care joacă roluri distincte în eliberarea veziculelor presinaptice. Funcțiile in vivo ale Liprin-α în sinapse au fost cel mai bine studiate la nevertebrate. Caenorhabditis elegans SYD-2 și Drosophila Liprin-α sunt localizate în centrul zonelor active presinaptice și sunt necesare pentru organizarea zonei active în diferite tipuri de neuroni (Zhen și Jin, 1999; Kaufmann și colab., 2002; Yeh și colab., 2005; Fouquet și colab., 2009; Stigloher și colab., 2011).

În neuronii motori specifici hermafroditului C. elegans (HSN), SYD-2/Liprin-α și o proteină RhoGAP SYD-1 sunt esențiale pentru asamblarea componentelor presinaptice din aval. Activitatea SYD-2 depinde în parte de ELKS-1 și de un nou regulator negativ RSY-1 (Dai și colab., 2006; Patel și colab., 2006; Patel și Shen, 2009). Am raportat anterior că o mutație missense, syd-2 (ju487gf), modifică Arg184 la Cys în domeniul LH1 și provoacă un efect de câștig de funcție, astfel încât proteina mutantă să poată promova asamblarea componentelor sinaptice chiar și în absența SYD-1 (Dai și colab., 2006). Supraexprimarea SYD-2 poate, de asemenea, să ocolească cerința SYD-1 (Dai și colab., 2006; Patel și colab., 2006). Aceste observații arată că activitatea SYD-2 este critică pentru asamblarea presinaptică adecvată. Au fost raportate anterior interacțiuni homomerice ale SYD-2/Liprin-α (Serra-Pagès și colab., 1998; Wagner și colab., 2009; Astigarraga și colab., 2010). Cu toate acestea, rămâne puțin înțeles dacă interacțiunea homomeră este importantă pentru funcția lor și modul în care este mediată.

Aici, am efectuat studii transgenice și biochimice pentru a aborda rolul domeniului conservat LH1 al SYD-2. Datele noastre susțin o propunere care auto-asamblează proprietatea SYD-2/Liprin-α mediată de dimerizarea domeniului LH1 promovează o ordine mai mare de oligomerizare și grupare, care este esențială pentru formarea presinaptică.

Materiale și metode

Construcția plasmidei.

Plasmidele de expresie au fost generate urmând metode standard sau folosind sistemul de clonare Gateway (Invitrogen). Promotorii Prgef-1 și Punc-86 au fost utilizați pentru expresiile pan-neuronale și respectiv HSN. Construcțiile SYD-2 mutante sau Liprin-α1A umane au fost realizate prin PCR utilizând ADNc-uri ca șabloane (Serra-Pagès și colab., 1998; Zhen și Jin, 1999) și verificate prin secvențiere. Oligo nucleotidele pentru peptida GCN-IL (RMKQLEDKIEELLSKIYHLENEIARLKKLIGER) cu distanțiere (GGSGG) au fost utilizate pentru a genera SYD-2-DI. ADNc GIT-1 (Source BioScience) a fost donat în pPD49.26 cu YFP ca o etichetă C-terminal condusă de promotorul Punc-86. Informații detaliate pentru plasmide sunt disponibile la cerere.

C. elegans genetica și analiza transgenică.

Tulpinile de C. elegans au fost menținute pe plăci NGM la 20-22,5 ° C așa cum s-a descris anterior (Brenner, 1974). Mutațiile și transgenele marker utilizate au fost următoarele: syd-1 (ju2) II (Hallam și colab., 2002), syd-2 (ju37) X (Zhen și Jin, 1999), syd-2 (ok217) X, kyIs235 [Punc-86-snb-1: yfp; Punc-4-lin-10: dsred; Podr-1-dsred] (Shen și Bargmann, 2003), wyIs22 [Punc-86-gfp: rab-3; Podr-1-dsred] (Patel și colab., 2006), juEx1206 [Punc-86-ELKS-1: gfp; Pttx-3-rfp] (Dai și colab., 2006) și nqEx13 [Punc-86- GIT-1: yfp; Pttx-3-rfp]. Mai multe linii transgenice independente au fost obținute prin microinjecție urmând proceduri standard (Mello și colab., 1991) și una sau două linii reprezentative au fost încrucișate la diferite mutanți sau tulpini marker pentru analize. Funcția de ouă a fost evaluată prin scorul numărului de 1 d hermafrodite adulte care păstrează ouă mai vechi după stadiul de virgulă. Markerii de fluorescență sinaptică au fost analizați la animale vii folosind microscopii Zeiss Axioplan2 și Nikon DS-Qi1Mc. Intensitatea fluorescentă de vârf (medie pentru 10 pixeli) a punctului cel mai strălucitor din regiunea sinaptică vulvară a fost măsurată în imagini reprezentative utilizând software-ul NIS-Elements (Nikon).

Biochimie.

Proteinele de fuziune GST-, His6- și MBP recombinate au fost produse în BL21 (DE3) după incubare timp de 16 ore la 20-22 ° C. Proteinele His6 și GST au fost extrase prin sonicare în PBS, pH 7,4, cu 0,1% Triton X-100, 1 mm DTT și inhibitori de protează (Roche) și purificate cu rășină HisPur Cobalt (Thermo) și Glutation-Sepharose (GE Healthcare), respectiv, urmând protocoalele producătorului cu tamponul care conține 0,1% Triton X-100 pentru a evita agregarea. Pentru testul pull-down, supernatanții care conțin 2,5 μg de His6 marcat și 1, 5 sau 25 μg de proteine ​​de fuziune GST au fost incubați cu rășină HisPur Cobalt timp de 3 ore la 4 ° C. Pentru reticulare chimică, proteinele His6-SYD-2 (0,2 μg/μl) au fost incubate cu glutaraldehidă (0,0025 sau 0,005%) în PBS, pH 7,4, 150 mm imidazol, 0,1% Triton X-100 și 1 mm DTT timp de 5 minute la 20 ° C. Proteinele au fost separate prin SDS-PAGE, colorate cu colorant de gel fluorescent Flamingo (Bio-Rad) și detectate cu ImageQuant LAS4000 (GE Healthcare). Pentru analiza filtrării pe gel, MBP-LH1 purificat cu rășină de amiloză (NEB) (200 μg) a fost aplicat la o HPLC Agilent 1100 cu coloană PROTEIN KW-803 (Shodex) echilibrată cu fosfat de potasiu 20 mm, pH 6,8, clorură de sodiu 50 mm la debit de 0,5 ml/min, detectat de DAWN HELEOS 8+ și Optilab rEX (Wyatt).

Celulele COS-7 și CAD (Qi și colab., 1997) au fost transfectate cu plasmide FLAG- și EGFP-pcDNA3.1 în LipofectAMINE2000 (Invitrogen) și cultivate timp de 24 de ore. Pentru analiza Blue Native-PAGE, celulele COS-7 au fost lizate în PBS, pH 7,4, plus 0,1% Triton X-100 cu inhibitori de protează (Roche), iar supernatanții au fost separați în NativePAGE 4-16% Gel (Invitrogen) și detectat prin Western blot cu anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich). Celulele CAD au fost diferențiate prin privarea de ser și observate cu microscopul BZ-9000 (Keyence) după 48 de ore. Am cuantificat aria clusterelor cu niveluri ridicate de semnale GFP în neurite de ImageJ (NIH). Toate experimentele biochimice au fost efectuate de două sau trei ori și reproductibile.

Rezultate

Domeniul LH1 este necesar pentru funcția SYD-2 în ansamblul presinaptic

Proteinele SYD-2/Liprin-α împărtășesc compoziția domeniului conservat evolutiv (Fig. 1A, B). Pentru a diseca domeniile funcționale ale SYD-2 prin analize transgenice, ne-am concentrat asupra neuronilor C. elegans HSN, care formează sinapsele en passant pe neuronii VC și pe mușchii vulvali din regiunea vulvei și controlează comportamentul de depunere a ouălor (Fig. 2A) și colab. ., 1986; Shen și Bargmann, 2003). Aceste sinapse sunt vizualizate cu reporteri de proteine ​​presinaptice marcate cu fluorescență, cum ar fi proteinele veziculare sinaptice SNB-1 și RAB-3 și componentele zonei active GIT-1 și ELKS-1. La animalele de tip sălbatic, grupurile fluorescente pentru acești reporteri sunt vizibile în mod distinct la nivelul vulvei (Fig. 2B). La animalele cu pierderea funcției syd-2, syd-2 (ju37) și syd-2 (ok217), localizările sinaptice ale acestor markeri sunt nedetectabile sau diminuate în mare măsură, iar ouăle în vârstă sunt păstrate în corpul lor, așa cum a fost raportat anterior (Fig. 2B - F) (Dai și colab., 2006; Patel și colab., 2006).

Proteinele SYD-2/Liprin-α și rezumatul analizelor transgenice. A, Ilustrarea structurii domeniului C. elegans SYD-2 și a proteinelor Liprin-α1 umane. Sunt indicate omologia (procentul de reziduuri identice) și segmentele de bobine prevăzute (subliniate). B, Alinierea secvenței a domeniilor LH1 ale proteinelor SYD-2 și liprin-α umane. Reziduurile cu fundal negru și gri reprezintă respectiv reziduuri identice și similare. Asteriscul indică reziduul Arg184 de SYD-2. C, Rezumatul analizelor structurale-funcționale transgenice ale SYD-2. Sunt indicate structura constructelor SYD-2/Liprin-α și prezența (+) sau absența (-) a capacității de salvare a fenotipurilor syd-2 (lf) sau de suprimare a syd-1 (lf). Sunt enumerate liniile și plasmidele transgenice utilizate pentru expresia pan-neuronală și HSN (#).