Soo-Jung Lee

Departamentul de Alimentație și Nutriție, Colegiul de Științe Bio-Nano, Universitatea Hannam, 461-6 Jeonmin-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-811, Coreea.

Seon-Young Kim

Departamentul de Alimentație și Nutriție, Colegiul de Științe Bio-Nano, Universitatea Hannam, 461-6 Jeonmin-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-811, Coreea.

Hyesun Min

Departamentul de Alimentație și Nutriție, Colegiul de Științe Bio-Nano, Universitatea Hannam, 461-6 Jeonmin-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-811, Coreea.

Abstract

Introducere

Ingerarea acută sau cronică de etanol crește speciile reactive de oxigen (ROS) în ficat și plasmă, așa cum s-a demonstrat în studiile la animale și clinice [1-3]. Patogeneza bolii hepatice induse de alcool implică efectele adverse ale metaboliților etanolului și stresului oxidativ [4]. Stresul oxidativ din țesuturi se referă la generarea sporită de ROS și/sau la epuizarea antioxidanților [5]. Prin urmare, strategiile eficiente pentru a spori apărarea antioxidantă intracelulară și extracelulară în țesuturi pot ajuta la protejarea ficatului de leziuni.

Antioxidanții sunt esențiali pentru prevenirea leziunilor celulare cauzate de radicalii liberi. Vitaminele E (VE) și C (VC) sunt antioxidanți naturali care protejează împotriva deteriorării oxidative a radicalilor liberi. VE este principalul antioxidant liposolubil din ser și este transportat ca o componentă a lipoproteinei. VE scade în mod eficient susceptibilitatea in vitro și in vivo la peroxidarea lipidelor [6,7]. VC, un antioxidant solubil în apă, elimină radicalii apoși peroxil înainte de a deteriora lipidele [8].

Studiile anterioare au arătat că leziunea hepatică alcoolică indusă de etanol este asociată cu modificări ale metabolismului metioninei [21-23]. Ingerarea cronică de etanol scade concentrațiile plasmatice de folat și concentrațiile hepatice de S-adenosilmetionină (SAM) [24] și crește Hcy plasmatică și S-adenosilhomocisteina hepatică (SAH) la animale și oameni [18,22,23]. Epuizarea SAM hepatică și scăderea raportului SAM: SAH datorită expunerii cronice la etanol este asociată cu diferite grade de leziuni hepatice la animale, cum ar fi ficatul gras, inflamația și fibroza [18,21,23].

Scopul prezentului studiu a fost de a examina dacă stresul oxidativ indus de etanol și hepatotoxicitatea ar putea fi neutralizate prin suplimentarea dietetică cu VC sau VE la șobolani. Deoarece o dietă bogată în grăsimi joacă, de asemenea, un rol important în stresul oxidativ și în modificările hepatice patologice, șobolanii au fost hrăniți cu o dietă lichidă cu etanol de 36%, care era relativ scăzută în grăsimi (10%) pentru a examina toxicitatea hepatică datorată toxicității etanolului, mai degrabă decât o dietă bogată în grăsimi. Puține studii au examinat efectele suplimentelor VC sau VE asupra aminotiolilor plasmatici la șobolani tratați cronic cu etanol. Astfel, am măsurat activitățile de alanină transaminază plasmatică (ALT) și aspartat transaminază (AST) pentru a evalua hepatotoxicitatea și nivelurile plasmatice ale GSH, potențialul total de captare a radicalilor (TRAP), diene conjugate, aminotioli și SAM hepatic pentru a evalua modificările capacității antioxidante și stresul oxidativ.

Materiale și metode

Materiale

Sare L-homocistină, tri-n-butilfosfină, DL-metionină, metmioglobină, acid 2,2'-azino-bis (acid 3,2-etilbenzotiazolină-6-sulfonic) diamoniu (ABTS), heparină, ciclohexan, SAM și SAH au fost achiziționate de la Sigma (St. Louis, MO, SUA). Lactobacillus rhamnosus (ATCC 7469) a fost obținut din colecția American Type Culture Collection (Manassas, VA, SUA). Mediul de cazeină sărăcit cu acid folic a fost obținut de la Difco Laboratories (Detroit, MI, SUA). 7-Fluoro-benzo-2-oxa-1,3-diazol-4-sulfonat a fost obținut de la Wako Chemicals (Osaka, Japonia). Toate substanțele chimice au fost de cea mai mare puritate disponibile în comerț.

Animale și protocol experimental

Șobolani Wistar masculi de cinci săptămâni, cu o greutate de 170-180 g, au fost obținuți de la Orient Bio (Seongnam, Coreea) și au primit inițial o dietă chow până când au ajuns la greutăți corporale de 200-220 g. După o aclimatizare de 5 zile, animalele au fost repartizate aleatoriu la unul din cele patru grupuri de câte 8 șobolani fiecare: (1) grup de control (fără etanol); șobolanii au fost hrăniți cu o dietă lichidă care a fost în esență aceeași cu dieta descrisă de Lieber și DeCarli [25], cu excepția reducerii conținutului total de lipide de la 39,6 g/L la 10 g/L și adăugarea dextrinei-maltoză pentru a alcătui energia deficit. Proporția de energie din dieta lichidă de control a fost după cum urmează: 76% carbohidrați, 10% grăsimi și 14% proteine. Uleiul de soia a fost folosit ca sursă de grăsime în dieta lichidă. Etanolul a fost introdus în diete treptat timp de 5 zile. (2) grup Alc; proporțiile de energie în regimurile de șobolan hrănite cu etanol au fost după cum urmează: 36% etanol, 40% carbohidrați, 10% grăsimi și 14% proteine. (3) Grup Alc + VC (40 mg VC/100 g greutate corporală [BW]): aceste animale au fost hrănite cu dietă de etanol conținând 2 g VC/L (4) Alc + grup VE (0,8 mg VE/100 g BW): aceste animale au fost hrănite cu dietă cu etanol conținând 40 mg VE/L.

Animalele din grupurile hrănite în perechi (martor, grup Alc + VC și grup Alc + VE) au fost hrănite cu aceeași cantitate dietetică ca cea consumată de grupul Alc în ultimele 24 de ore. Cantitatea de dietă consumată a fost monitorizată zilnic, iar BW a fost măsurată săptămânal. Dietele au fost hrănite timp de 5 săptămâni. Șobolanii au fost adăpostiți individual în cuști de plastic într-o cameră cu temperatură (23 ± 1 ℃) și umiditate controlată (50 ± 5%) cu un ciclu de lumină zilnic de la 0600 la 2000 ore. Experimentele pe animale au urmat protocoalele stabilite de Ghidul NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Acest protocol de studiu a fost aprobat de comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (HNU 2011-05).

Colectie de mostre

La sfârșitul perioadei de hrănire de 5 săptămâni, șobolanii au fost postiti peste noapte și anesteziați cu dioxid de carbon. Probele de sânge au fost colectate prin puncție cardiacă în seringi heparinizate. Sângele a fost imediat centrifugat timp de 15 minute la 1.500 × g și 4 ℃ pentru a colecta plasma. Țesuturile hepatice au fost îndepărtate, spălate cu soluție salină rece ca gheața și congelate rapid în azot lichid. Probele au fost depozitate la -70 ° C până la analiză.

Analize biochimice ale plasmei și țesutului hepatic

ALT plasmatic, AST și trigliceride au fost măsurate folosind un autoanalizator fotometric (ERBA Chem Pro, Transasia Bio-Medicals, Mumbai, India). Nivelurile plasmatice de aminotioli incluzând Hcy total, Cys, CysGly și GSH au fost determinate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) simultan cu detectarea fluorometrică (excitație la 385 nm și emisie la 515 nm) conform Nolin și colab. [26]. Compușii aminotiolului au fost separați pe o coloană analitică Hypersil Gold ODS (250 × 4,6 mm ID, dimensiunea particulelor de 5 μm) (Thermo, Runcorn, Marea Britanie). Pentru a determina nivelurile hepatice de SAM și SAH, porțiuni de ficat înghețat au fost omogenizate cu 0,4 M HClO4 și centrifugate la 12.000 × g la 4 ℃ timp de 30 de minute. SAM și SAH au fost analizate prin HPLC echipat cu o coloană analitică ODS Betasil de 5 × μm cu ultrasunetă de 250 × 4,6 mm (Thermo) conform Wagner și colab. [27]. Folatul a fost analizat folosind o metodă de testare a microplăcii cu L. rhamnosus (ATCC 7469) în conformitate cu Tamura [28]. Porțiuni de ficat au fost omogenizate și autolizate pentru hidroliza resturilor de γ-glutamil în prezența ascorbatului de sodiu la 37 ℃. Pentru testul de folat s-au utilizat supernatanți ai omogenatului hepatic și probe de plasmă.

TRAP a fost analizat pentru a măsura potențialul antioxidant folosind un test de inhibare conform Rice-Evans și Miller [29]. Probele de plasmă au fost incubate cu o peroxidază (met-mioglobină) și H2O2 pentru a produce cationul ABTS +. A apărut o culoare albastru-verde relativ stabilă și a fost măsurată la 30 ℃ și 740 nm. Antioxidanții din probele de plasmă au provocat suprimarea acestei producții de culoare într-un grad proporțional cu concentrația lor. Procedura standard de testare TRAP a constat în determinarea capacității antioxidante echivalente Trolox (mmol/L). Oxidarea lipoproteinelor cu densitate scăzută (LDL) a fost identificată prin măsurarea formării dienelor conjugate (CD) pentru a evalua peroxidarea timpurie a lipidelor. LDL a fost izolat cu heparină tamponată așa cum s-a descris anterior [30-32]. Lipidele au fost extrase din probe de LDL cu cloroform-metanol (2: 1) și uscate sub azot, apoi redizolvate în ciclohexan pentru a estima oxidarea LDL. Cantitatea de CD în LDL a fost evaluată prin monitorizarea modificării absorbanței la 234 nm la momentele indicate [33]. Rezultatele sunt exprimate ca olmol/L.

analize statistice

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± eroare standard. Diferențele dintre grupurile experimentale au fost identificate prin analiza unică a varianței. Testele cu interval multiplu ale lui Duncan au fost folosite ca test post hoc și un tabel P 1). În perioada de 5 zile pentru a introduce treptat etanol în dietele lichide, șobolanii hrăniți fie cu dieta Alc, fie cu Alc + VC s-au îngrășat mai mult. Prin urmare, greutatea corporală inițială a șobolanilor hrăniți cu dieta Alc a fost mai mare decât cea din grupul de control (P Tabelul 2). Suplimentarea VE la șobolani hrăniți cu etanol a restabilit activitatea plasmatică a AST pentru a controla nivelurile. Cu toate acestea, suplimentarea cu VE nu a modificat trigliceridele plasmatice. Suplimentarea cu VC a avut tendința de a reduce ALT și AST plasmatice, dar diferența nu a fost semnificativă.

masa 2

Efectele suplimentării cu vitamina C și E asupra aminotransferazelor plasmatice și a trigliceridelor la șobolanii tratați cu etanol cronic

efectele

Datele sunt medii ± SE (n = 8). Valorile care nu împărtășesc o literă cu indicativ comun sunt semnificativ diferite în tabelul P 3). Suplimentarea cu VC sau VE nu a afectat concentrațiile plasmatice de Hcy și Cys în comparație cu alimentarea cu etanol singur, dar nivelurile plasmatice de GSH la șobolanii hrăniți cu etanol au crescut la șobolanii suplimentați cu VC (P Tabelul 4). Folatul plasmatic a fost semnificativ mai mare la șobolanii cărora li s-a administrat Alc + VC decât cei cărora li s-a administrat Alc în monoterapie. SAM hepatică a fost mai mică la șobolanii cărora li s-a administrat Alc (P Tabelul 5). Suplimentarea cu VC a crescut nivelul de TRAP plasmatic la șobolanii hrăniți cu etanol, comparativ cu cei de hrană cu etanol singur, dar nivelul CD a rămas neschimbat la șobolanii cărora li s-a administrat Alc + VC. Suplimentarea cu VE a crescut semnificativ nivelul TRAP plasmatic, dar a scăzut nivelul CD la șobolanii hrăniți cu etanol comparativ cu cei de la șobolanii hrăniți cu etanol singur.

Tabelul 5

Efectele suplimentării cu vitamina C și E asupra potențialului total de captare a radicalilor în plasmă (TRAP) și a dienelor conjugate la șobolanii tratați cu etanol cronic

Datele sunt medii ± SE (n = 8). Valorile care nu împărtășesc o literă supercriptă comună sunt semnificativ diferite la P Vendemiale G, Grattagliano I, Signorile A, Altomare E. Modificări induse de etanol ale compartimentării intracelulare a tiolului și statusul redox al proteinelor în ficatul șobolanului: efectul tauroursodeoxicolatului. J Hepatol. 1998; 28: 46–53. [PubMed] [Google Scholar]