Isabel S. Novella

Departamentul de Microbiologie și Imunologie Medicală, Colegiul de Medicină, Universitatea din Toledo Campus de Științe ale Sănătății, Toledo, Ohio, SUA a

John B. Presloid

Departamentul de Microbiologie și Imunologie Medicală, Colegiul de Medicină, Universitatea din Toledo Campus de Științe ale Sănătății, Toledo, Ohio, SUA a

Cameron Beech

Departamentul de Microbiologie și Imunologie Medicală, Colegiul de Medicină, Universitatea din Toledo Campus de Științe ale Sănătății, Toledo, Ohio, SUA a

Claus O. Wilke

Center for Computational Biology and Bioinformatics, Section of Integrative Biology, and Institute for Cellular and Molecular Biology, Universitatea din Texas la Austin, Austin, Texas, SUA b

Date asociate

Abstract

INTRODUCERE

Replicarea predispusă la erori în virusurile ARN are ca rezultat dezvoltarea populațiilor de cvasispecii (1-4), nori de mutanți strâns înrudiți în echilibrul de selecție a mutațiilor (5-7). La populațiile de cvasispecii, robustețea genetică crescută poate oferi un avantaj selectiv (8-11), deoarece un număr mai mic de descendenți se pierd din cauza mutațiilor dăunătoare sau letale. Robustețea genetică aici este definită ca invarianță fenotipică în ciuda presiunii mutaționale (12). În ceea ce privește peisajele de fitness, selecția pentru rezistență favorizează acele populații care stau pe vârfuri de fitness largi în loc de vârfuri de fitness înguste. Studiile asupra organismelor digitale au arătat preferința pentru acest tip de vârfuri largi și au condus la expresia „supraviețuirea celor mai plate” (13). Multe dintre studiile care abordează relevanța robusteții genetice asupra evoluției moleculelor de ARN sunt analize computerizate și evoluție simulată (11, 14-17). Această abordare a condus la identificarea selecției pentru robustețe în genomii virusului hepatitei C (18) și microARN (19).

Înțelegerea solidității este de o relevanță deosebită pentru dezvoltarea medicamentelor antivirale și a vaccinurilor. Mutageneza letală (30) constă în creșterea ratelor de mutație pentru a produce populații cu atât de multe mutații încât informațiile genetice se pierd și virusul nu se poate reproduce (3, 6, 31). Această abordare ar avea o valoare limitată dacă virusul se poate adapta prin creșterea robusteții sale (32), dar simulările pe computer sugerează că robustețea genetică de la sine este puțin probabil să prevină dispariția prin mutageneză letală (33). În picornavirusuri pare să existe o corelație între robustețe și sensibilitate la mutageneza letală (34). Dezavantajul major al vaccinurilor vii atenuate este posibilitatea de reversie în timpul replicării la vaccinat. În termeni simpli, reversiunea este un caz de adaptare la gazda umană și, deoarece această adaptare depinde de disponibilitatea variației benefice, este ușor să ne imaginăm că o tulpină de vaccin mai robustă ar fi, de asemenea, o tulpină de vaccin mai sigură. Cu toate acestea, dacă limitele de robustete crescute sau favorizează evoluția este controversat (35-37).

Considerațiile teoretice și moleculare oferă o legătură între robustețea genetică și termostabilitate (38-40), iar lucrările asupra fagului phi-6 au arătat că clonele cu robustețe ridicată au dezvoltat o termostabilitate mai mare decât clonele cu robustețe scăzută (41). Lucrările asupra microARN-ului sunt controversate și, în timp ce rezultatele experimentale păreau să arate robustețe genetică și toleranță termică necorelate (19), există un dezacord cu privire la interpretarea datelor (42).

În prezentul raport, am folosit tulpini VSV nemutagenizate pentru a testa dacă selecția crescută sau relaxată a dus la modificări ale robusteții genetice și dacă există o corelație între robustețe și termostabilitate. Am analizat o colecție de tulpini pe care le-am generat prin pasaje placă-placă (43, 44) sau prin pasaje cu populație mare (29). Pasajele placă-placă minimizează selecția, în timp ce pasajele cu populație mare maximizează selecția. Rezultatele noastre au indicat că, așa cum s-a prezis, în absența selecției a existat o pierdere de robustețe, în timp ce în prezența selecției sa îmbunătățit robustețea. Am constatat, de asemenea, că robustețea nu este necesară pentru a acoperi cu termostabilitate în VSV; cu toate acestea, în absența selecției, arhitectura genetică VSV pare să impună o relație moderat puternică între robustețe și termostabilitate. În cele din urmă, în mod neașteptat, termostabilitatea a crescut în timpul pasajelor placă-placă, chiar dacă robustetea a scăzut.

MATERIALE ȘI METODE

Celule și viruși.

Determinări de fitness.

Starea de fitness a fost măsurată în competiție directă, așa cum s-a descris anterior (45, 49). Pentru tulpinile derivate din greutate, am utilizat MARM U ca referință, iar pentru tulpinile derivate din MART am folosit greutatea ca referință. În rezumat, cei doi concurenți au fost amestecați și amestecurile utilizate pentru a determina raporturile relative folosind teste de placă în prezența și absența I1 MAb și, de asemenea, pentru a efectua un pasaj de competiție cu 2 × 105 PFU. După 20 până la 24 de ore, titrurile de virus au atins aproximativ 10 10 PFU/ml, iar descendenții din competiție au fost folosiți pentru cuantificarea rapoartelor și pentru a efectua un al doilea pasaj de competiție în aceleași condiții. După mai multe pasaje, modificările jurnalului în raport au fost reprezentate în raport cu timpul, iar antilogaritmul pantei potrivirii a fost valoarea de fitness.

Măsurători de rezistență.

Am folosit rezistența la mutageneză ca surogat al robusteții. Am însămânțat baloane T-25 cu celule BHK-21 și, după creștere peste noapte, am tratat monostratele semiconfluente rezultate cu 5 ml soluție de 5-fluorouracil (FU) dizolvată în MEM plus FBS la o concentrație finală de 0 (martor), 10, 35 sau 100 μg/ml. După 6,5 ore de incubație la 37 ° C, timp în care concentrația medicamentului în interiorul celulelor echilibrează, monostratele au fost infectate cu aproximativ 105 PFU, iar infecțiile au fost monitorizate pentru efectul citopatic (CPE), care s-a dezvoltat mai lent cu concentrații crescute de mutagen, deci în absența mutagenului a fost complet la 24 h postinfecție, în prezența a 10 μg/ml a durat 48 h, iar în prezența a 35 sau 100 μg/ml a durat 72 h. Toate tulpinile au fost recuperate în același timp în prezența unei cantități date de medicament. Când CPE a fost completă, am recuperat randamentele virale și am determinat titrurile prin testul duplicat al plăcii. Am normalizat apoi titrurile împărțindu-le la titrul de control.

Pentru a cuantifica robustețea, am regresat titlurile normalizate, transformate în log, față de concentrațiile de FU transformate în rădăcină pătrată. Datele au fost aproape liniare după această transformare pentru toți mutanții (vezi cifrele din materialul suplimentar). Linia de regresie a fost potrivită fără o interceptare, deoarece titrul normalizat transformat în jurnal trebuie să fie zero prin definiție. Am folosit panta liniei ca măsură a robusteții noastre. Toate valorile pantei sunt negative și o pantă mai negativă indică o sensibilitate mai mare la FU și, prin urmare, o rezistență mai mică.

Determinări ale frecvenței mutante.

Pentru wt și populații derivate, am determinat frecvența mutanților rezistenți la I1. Probele din stocurile înghețate au fost diluate după cum este necesar și titrate în teste de placă triplicate fără I1 pentru a calcula concentrația totală de virus. În paralel, am folosit probe mai concentrate (de obicei cu 3 până la 4 ordine de mărime mai concentrate) pentru a efectua teste de placă în prezența concentrațiilor în exces de I1 în suprapunerea de agaroză. Foarte important, nu am tratat virusul cu anticorpi înainte de placare, deoarece acest tratament ar duce la subestimarea semnificativă a frecvențelor mutante datorită amestecării și ascunderii fenotipice (50, 51). Numerele de plăci în aceste condiții ar reprezenta numărul de mutanți MARM din stoc. Pentru a calcula frecvența mutantului, am determinat mediile MARM împărțite la mediile în greutate.

MARM U și populațiile derivate sunt deja rezistente la I1 și la alți anticorpi direcționați către situsul A, cum ar fi I3 (52, 53), de aceea am folosit I14, un alt anticorp care recunoaște un situs antigenic diferit (situsul B) (52, 53). Procedurile pe care le-am urmat au fost aceleași cu cele pentru frecvența mutantelor rezistente la I1, cu excepția modificării anticorpilor în suprapunerile de agaroză semisolidă.

Cuantificarea raporturilor fizice particule-particule infecțioase.

Determinarea termostabilității.

Am măsurat termostabilitatea la 37 și 39 ° C. Am luat 500 μl de stoc de virus într-un tub Eppendorf și l-am plasat într-un incubator la 37 ° C. Am prelevat probe de 100 μl la momentul zero, am diluat fiecare probă după nevoie după 1, 2 și 3 zile și am efectuat teste de placă în triplicat. Panta de supraviețuire a virusului în funcție de timp oferă o măsurare a termostabilității. Am exclus o contribuție potențială de agregare și aderență la peretele tubului în toate tulpinile gâtului de sticlă cu mutații în G ORF, care au dus la valori care nu au fost semnificativ diferite de cele din testele din tuburile de plastic (P = 0,243 de către test t asociat).

REZULTATE

Robustețea crește în timpul evoluției adaptive.

Una dintre predicțiile teoriei cvasispeciei este că adaptarea va produce populații de robustețe crescută. Am testat această ipoteză determinând sensibilitatea la FU în populațiile VSV generate după 25 de pasaje cu populație mare (w25A, w25D și w25E). În aceste condiții, selecția pentru o formă fizică sporită este forța evolutivă predominantă, iar forma fizică virală crește constant (29, 56). Figura 1A arată că populațiile selectate au avut o rezistență semnificativ mai mare la FU decât progenitorul în greutate (P = 0,006 prin testul t cu o probă; n = 3). (Am calculat rezistența/rezistența la FU ca panta într-o regresie a titrului viral normalizat transformat în log față de rădăcina pătrată a concentrației FU [vezi Fig. S1 în materialul suplimentar]. Numerele mai negative implică o rezistență mai mică. )

virusul

Evoluție sub selecție. (A) Modificări ale robusteții. Tulpinile de greutate adaptate au o rezistență semnificativ ridicată în comparație cu greutatea. (B) Modificări ale raportului dintre particulele fizice și PFU. Tulpinile de greutate adaptate au raporturi semnificativ mai mici. (C) Frecvența mutantă versus robustețe pentru cele trei tulpini de greutate adaptate. Frecvența mutantelor pare să crească odată cu robustețea. Cu toate acestea, această tendință nu este semnificativă.

Testele de placă măsoară virusul viu și nu pot da estimări ale mutațiilor letale. Am testat dacă diferențele de sensibilitate FU se corelează cu modificările frecvenței mutanților care poartă mutații letale prin determinarea raporturilor fizice particule/particule infecțioase. Am folosit transcrierea inversă cantitativă-PCR pentru a măsura numărul de copii ale ARN genomic, care reprezintă numărul de particule fizice din VSV. Rapoartele moleculei de ARN/PFU ale tulpinilor aflate în selecție (w25A, w25D și w25E) au fost semnificativ mai mici decât cele ale progenitorului wt (P = 0,01 prin testul t cu o singură probă; n = 2) (Fig. 1B), sugerând că rata mutației dăunătoare a fost mai mică la selecție, oferind dovezi suplimentare că aceste populații virale au o rezistență mai mare.

Am testat dacă rezistența crescută la FU se datorează diferențelor în numărul de mutații încorporate în timpul mutagenezei. De exemplu, o rezistență mai mare ar putea fi rezultatul unei fidelități mai mari a polimerazei sau a unei afinități scăzute pentru medicament. Dacă acesta ar fi fost cazul, ne-am aștepta la o corelație inversă între frecvența mutantului și rezistența la FU. Am infectat monostraturile BHK-21 în prezența a 10 μg/ml FU și am măsurat frecvența mutanților rezistenți la I1 printre descendenți. Am constatat că frecvența mutantelor a crescut odată cu robustețea; cu toate acestea, această tendință nu a fost semnificativă (Fig. 1C) și niciuna dintre tulpinile selectate nu a avut frecvențe mutante mai scăzute decât greutatea. Prin urmare, putem exclude fidelitatea crescută a polimerazei ca un factor care contribuie la creșterea rezistenței la FU.

Robustețea se pierde în timpul derivei aleatorii.

Există mai mulți factori de mediu care scad eficiența selecției. Selecția în populațiile virale poate fi minimizată prin coinfecție din cauza complementării, ceea ce duce la pierderea generală a robusteții în fagul ARN phi-6 (26). Un alt mijloc de a minimiza selecția este prin transmiterea întâmplătoare a particulelor virale individuale. Acest tip de regim reprezintă cel mai extrem blocaj și poate fi efectuat cu ușurință în laborator prin alegerea aleatorie a plăcilor individuale (46). În aceste condiții, domină deriva aleatorie și există o pierdere generală de fitness (46). Am emis ipoteza că robustețea va evolua urmând același model, deci ar exista o pierdere generală de robustețe.

Am testat 16 tulpini VSV generate din MARM U prin 20 de treceri de la placă la placă. Așa cum am făcut înainte, am stabilit mai întâi sensibilitatea lor la FU (vezi Fig. S2 în materialul suplimentar) și am comparat-o cu cea a progenitorului lor MARM U. Figura 2A prezintă rezultatele, care au susținut ipoteza noastră. Toate cele 16 tulpini au fost mai sensibile la FU decât progenitorul MARM U. Acest rezultat a fost extrem de semnificativ (P = 0,000015 prin testul cu o probă t; n = 16).

Evoluția sub derivă. (A) Modificări ale robusteții. Tulpinile MR au redus semnificativ robustețea în comparație cu MARM U. (B) Modificări ale raportului dintre particulele fizice și PFU. Nu există nicio diferență semnificativă între MARM U și tulpinile MR. (C) Frecvența mutantă versus robustețea pentru tulpinile MR (fără MRz outlier; r = 0,34; P = 0,27). Nu observăm nicio corelație între frecvența mutanților și robustețe.

Următorul experiment a constat în determinarea rapoartelor fizice particule/PFU. Au existat variații semnificative între tulpini (Fig. 2B), dar în general nu au existat modificări ale rapoartelor (P = 0,15 prin testul t cu o singură probă; n = 16).

În cele din urmă, am investigat posibilitatea ca diferențele de sensibilitate la FU să fie datorate diferențelor de precizie a polimerazei în prezența mutagenului. Din nou, am calculat frecvența mutantelor la aceste populații după replicare în prezența a 10 μg/ml FU. Deoarece toți sunt descendenți ai MARM U, sunt deja pe deplin rezistenți la anticorpul I1, astfel am testat rezistența la anticorpul I14, care recunoaște un site antigenic diferit în glicoproteina G (52, 53). Nu am găsit nicio corelație între frecvența mutanței și robustețe (r = -0,014; P = 0,96; n = 13), deci nu am putut explica robustețea mai mică ca urmare a unor rate mai mari de mutație (Fig. 2C). Acest rezultat este în concordanță cu constatarea noastră anterioară că MRr și MRb au frecvențe mutante genomice care nu diferă de cea a progenitorului lor MARM U (29).

O corelație între fitness și robustețe.

Teoria cvasispeciei prezice că selecția afectează două trăsături fenotipice: fitness și robustețe. Am constatat că un regim care minimizează selecția, cum ar fi pasajele de la placă la placă, a dus, în general, atât la pierderea stării de fitness, cât și la pierderea robusteții (Fig. 3; vezi și Fig. S2 în materialul suplimentar). În contrast, am constatat că un regim care maximizează selecția, cum ar fi pasajele cu populație mare, a produs tulpini cu o formă fizică sporită și o robustețe crescută (Fig. 3; vezi și Fig. S1). Mai mult, luând împreună rezultatele pentru toate tulpinile, am găsit o corelație excelentă și semnificativă statistic între fitness și robustețe (Fig. 3), care este în concordanță cu previziunile teoretice luate în considerare.

Fitness versus robustete pentru toate tulpinile utilizate în acest studiu. Simbolurile se referă la tulpini: cerc solid, tulpini MR; cerc deschis, MARM U; triunghiuri solide, tulpini de greutate adaptate; triunghi deschis, wt. Există o puternică corelație pozitivă între fitness-ul transformat în jurnal și robustețe (linie punctată; r = 0,57; P = 0,009; fără valoarea anterioară MRq, r = 0,85 și P = 4,197e −06).

O corelație imperfectă între robustețe și termostabilitate.

Termostabilitate versus robustete pentru toate tulpinile utilizate în acest studiu. Simbolurile se referă la tulpini: cerc solid, tulpini MR; cerc deschis, MARM U; triunghiuri solide, tulpini de greutate adaptate; triunghi deschis, wt. Există o corelație pozitivă între termostabilitate și robustețe pentru tulpinile MR la 37 ° C (linie punctată; r = 0,58; P = 0,018; fără valoarea exterioară MRi, r = 0,79 și P = 0,0004) (A) și la 39 ° C punctat linie; r = 0,74; P = 0,016) (B).

DISCUŢIE

Am arătat că robustețea mutațională a VSV se poate schimba substanțial în timpul evoluției, chiar și atunci când robustețea în sine nu se află sub selecție. Așa cum prevede teoria, selecția simplă pentru o stare fizică sporită duce la evoluția unei robustețe crescute; este probabil ca virusul să maximizeze condiția fizică cel puțin parțial prin reducerea efectului dăunător al mutațiilor. În contrast, în cazul derivei aleatorii, robustețea scade semnificativ. Această constatare susține din nou argumentul teoretic că robustețea este o proprietate evoluată (16, 38, 57).

Rezultatele prezentate aici sunt în concordanță cu lucrările anterioare în care am demonstrat o rezistență MRr scăzută folosind distribuții de fitness (29). Aici, am folosit sensibilitatea la FU pentru a ajunge la aceeași concluzie. Mai mult, MRr a fost una dintre cele mai sensibile tulpini, doar MRz și Jerry având valori mai mici (vezi Fig. S2 în materialul suplimentar). În schimb, folosind distribuții de fitness, nu am reușit să găsim un defect de adaptabilitate în MRb și numai după o perioadă de adaptare au existat dovezi de robustețe scăzută (29). Cu toate acestea, folosind sensibilitatea la FU, am găsit o diferență între robustețea MRb (-1,84 ± 0,099) și progenitorul său, MARM U (-1,55 ± 0,035). Acest rezultat demonstrează că măsurarea rezistenței la mutageneză este o metodă mai sensibilă decât alternativa consumatoare de timp a măsurării fitnessului plăcilor individuale pentru a produce distribuții de fitness.

Interesant este faptul că toate tulpinile aflate în derivă aleatorie au avut o pierdere de robustețe, chiar și cele care au crescut în condiții de fitness (MRa și MRy). Nu a existat nicio corelație între robustețe și numărul de mutații acumulate în timpul derivei (neprezentate) și am identificat pierderea robusteții la tulpini care difereau de progenitorul MARM U în doar două mutații (MRb, MRe și MRl). Acest rezultat nu este surprinzător din cauza dovezilor crescânde ale epistazei răspândite în genomul virusurilor ARN (44, 58-61).

Nu a existat nicio diferență între robustețea MARM U (-1,55 ± 0,03) și greutatea (-1,57 ± 0,04), dar în mod surprinzător, am găsit diferențe semnificative în termostabilitate. MARM U a fost semnificativ mai termostabil decât greutatea (P = 0,015 prin testul t cu două eșantioane; diferența de medii, 0,12). Faptul că diferența dintre cele două tulpini este o singură mutație în glicoproteină care are ca rezultat o modificare a recunoașterii anticorpilor (53) ridică posibilitatea unei corelații între antigenicitate și termostabilitate, pe care o explorăm în prezent.