Mingsan Miao

Universitatea Henan de Medicină Tradițională Chineză, Zhengzhou 450008, provincia Henan, China

Xuexia Zhang

Universitatea Henan de Medicină Tradițională Chineză, Zhengzhou 450008, provincia Henan, China

Linan Wang

Universitatea Henan de Medicină Tradițională Chineză, Zhengzhou 450008, provincia Henan, China

Contribuțiile autorului: Mingsan Miao a proiectat acest experiment. Xuexia Zhang și Linan Wang au colectat datele. Xuexia Zhang a scris articolul. Mingsan Miao a examinat datele. Toți autorii au aprobat versiunea finală a lucrării.

Abstract

S-a demonstrat că frunza de kaki îmbunătățește rezultatele ischemice cerebrale; cu toate acestea, mecanismul său de acțiune rămâne neclar. În acest studiu, șoarecii au fost supuși la 10 minute de precondiționare ischemică, iar flavonoidul din frunze de kaki a fost administrat oral timp de 5 zile. Rezultatele au arătat că flavonoidul frunzei de kaki a îmbunătățit semnificativ conținutul activatorului plasminogenului de tip tisular și al 6-ceto prostaglandinei-F1 α în cortexul cerebral, a scăzut conținutul de tromboxan B2 și a redus conținutul inhibitorului activatorului plasminogen-1 la șoareci. În urma microscopiei optice, s-a arătat, de asemenea, că flavonoidul frunzei de kaki reduce umflarea celulelor și hipercromatismul nuclear în cortexul cerebral și hipocampul șoarecilor. Aceste rezultate au sugerat că flavonoidul din frunze de kaki poate inhiba în mod eficient tromboza creierului, poate îmbunătăți alimentarea cu sânge a creierului și poate ameliora leziunile patologice induse de ischemie, rezultând o toleranță ischemică a creierului.

Repere ale cercetării

(1) Acest studiu a verificat că flavonoidul din frunze de kaki poate induce toleranță ischemică cerebrală.

(2) Mecanismul care stă la baza efectului neuroprotector al flavonoidului frunzei de kaki împotriva leziunii ischemiei cerebrale a implicat dizolvarea trombului, reducerea afectării celulelor endoteliale, creșterea toleranței ischemice a creierului și reducerea infarctului cerebral.

INTRODUCERE

Precondiționarea ischemiei cerebrale tranzitorii poate induce un efect protector endogen (reducând efectiv evenimentele ischemice cerebrale grave, chiar fatale), ameliorează leziunile tisulare ischemice și poate induce toleranță ischemică cerebrală [1]. Datele clinice au arătat că, atunci când apare infarctul cerebral, zona infarctului este mai mică și prognosticul este mai bun la pacienții care au suferit anterior atacuri ischemice cerebrale tranzitorii în comparație cu cei fără ischemie necerebrală [2]. Aceste descoperiri indică efectele protectoare cerebrale ale precondiționării ischemice. Mecanismele de protecție endogene ale toleranței ischemice cerebrale și precondiționarea implică o gamă largă de mecanisme care nu au fost complet elucidate [3,4,5,6]. Un studiu anterior a arătat că precondiționarea ischemică îmbunătățește funcția de reglare a microcirculației [7], promovează deschiderea capilarelor sanguine și a fluxului sanguin microvascular, reduce hipoperfuzia fluxului sanguin tisular în timpul ischemiei și lipsa de reflux în timpul reperfuziei, promovează perfuzia și recuperarea eficientă a țesuturilor, previne rănirea ulterioară a celulelor tisulare, reduce deteriorarea țesuturilor și favorizează recuperarea după rănire.

REZULTATE

Analiza cantitativă a animalelor experimentale

Șoarecii (n = 126) au fost împărțiți în mod aleatoriu în șapte grupuri: grupul de chirurgie simulată (administrare intragastrică de ser fiziologic), grup ischemie/reperfuzie (ischemie/reperfuzie + administrare intragastrică de ser fiziologic), grup model preprocesare (condiționare ischemică 10 minute + ischemie/reperfuzie + administrare intragastrică de soluție salină), grupuri flavonoide cu frunze de persimmon cu doze mari, moderate și mici (ischemie/reperfuzie + 400, 200 și 100 mg/kg flavonoid din frunze de persimmon) și grupul ginaton (ischemie/reperfuzie + 40 mg/kg ginaton). Fiecare grup conținea 18 șoareci. Deoarece 36 de șoareci au murit în timpul operației, au existat 18 șoareci în grupul de intervenție chirurgicală simulată, 12 șoareci în grupul de ischemie/reperfuzie, 10 șoareci în grupul model de preprocesare, 12 șoareci în grupurile cu flavonoide cu frunze de persimmon cu doze mari și moderate, 11 șoareci din grupurile cu flavonoide cu frunze de persimmon cu doze mici și 15 șoareci din grupul ginaton. Un total de 90 de șoareci au fost incluși în analiza finală.

Efectul flavonoidului frunzei de kaki asupra afectării patologice a țesutului cerebral la modelul ischemiei cerebrale la șoarece

tabelul 1

Efectul flavonoidului frunzei de kaki asupra afectării patologice a țesutului cerebral

induce

Membrana celulară și nucleolii neuronilor din cortexul cerebral și hipocampus au fost clar vizibili în grupul de chirurgie simulată. În grupul de ischemie/reperfuzie au fost observate umflături celulare, creșteri ale volumului celular, pihnoză și citoplasmă și nuclee colorate în albastru. Umflarea celulară și nucleele ușor colorate au fost detectabile în grupul model de preprocesare (Figura 1).

Efectul flavonoidului frunzei de kaki asupra morfologiei patologice în cortexul cerebral și hipocampul în modelul ischemic al șoarecelui (colorare hematoxilină-eozină, × 400). Săgețile arată celulele nervoase. Comparativ cu grupul model de preprocesare, umflarea celulelor și numărul de nuclee ușor colorate au fost reduse în grupul ginaton, grupuri cu flavonoide cu frunze de persimmon cu doze mari, moderate și mici. Mai mult, grupul cu ginaton și grupul cu flavonoide cu frunze de persimmon cu doze mari au avut un efect mai mare.

Comparativ cu grupul model de preprocesare, umflarea celulară și numărul de nuclee ușor colorate au fost reduse în grupul ginaton și în grupurile cu flavonoide cu frunze de persimmon cu doze mari, moderate și mici. Cu toate acestea, efectele au fost cele mai mari în grupul cu flavonoide cu frunze de caimon și cu doze mari (Figura 1).

Efectul flavonoidului de frunze de kaki asupra activatorului plasminogenului de tip țesut plasmatic și a nivelului inhibitorului 1 al activatorului de plasminogen

masa 2

Efectul flavonoidului din frunze de caki asupra activatorului plasminogenului de tip țesut plasmatic (t-PA; ng/mL) și a inhibitorului activatorului plasminogen-1 (PAI-1; ng/mL)

Efectul flavonoidului frunzei de kaki asupra nivelurilor de tromboxan B2 și 6-ceto prostaglandină-F1 α

Tabelul 3

Efectul flavonoidului frunzei de kaki asupra tromboxanului B2 (TXB2; pg/mL), 6-ceto prostaglandină-F1 α (6-Keto-PGF1α; pg/mL) și TXB2/6-Keto-PGF1α la șoarecii cu ischemie cerebrală

DISCUŢIE

Studii recente au arătat că sincronizarea și doza sunt cei doi factori principali pentru o toleranță ischemică cerebrală eficientă [11]. S-a dovedit că toleranța ischemică cerebrală este indusă după 120 de ore de precondiționare ischemică [12]. În prezent, există puține studii care investighează toleranța ischemică cerebrală și chiar mai puține studii care utilizează ingrediente eficiente din medicamentele din plante chinezești pentru a îmbunătăți toleranța ischemică cerebrală. Acest studiu a observat că flavonoidul din frunze de kaki a redus tromboza creierului, a îmbunătățit aportul de sânge și a ameliorat leziunile cauzate de ischemie prin îmbunătățirea toleranței ischemice cerebrale.

Rezultatele experimentale au arătat că numărul de celule neuronale a scăzut, iar unele celule au fost umflate în mod semnificativ după leziuni de reperfuzie a ischemiei cerebrale. Cu toate acestea, în grupul model de preprocesare, umflarea celulară a fost redusă semnificativ în zona infarctului. Numărul de celule nervoase cu structură integrată a crescut semnificativ. În grupurile flavonoide ale frunzei de kaki, umflarea celulelor s-a redus și au existat celule nervoase abundente cu structură integrată. Aceste rezultate au sugerat că precondiționarea ischemică de 10 minute poate promova recuperarea funcției neurologice după ischemie cerebrală, reduce efectiv severitatea acesteia și induce apariția toleranței ischemice.

Studii farmacologice recente au arătat că flavonoidul frunzei de kaki are efecte farmacologice largi, inclusiv vasodilatație, proprietăți de scădere a lipidelor, un efect hipoglicemiant [22] și un efect antioxidant [23].

MATERIALE ȘI METODE

Proiecta

Un experiment randomizat, controlat pe animale.

Timp și setare

Experimentele au fost efectuate în Laboratorul de farmacologie, Colegiul Henan de Medicină Tradițională Chineză, China, din noiembrie până în decembrie 2009.

Materiale

Animale

Șoarecii Kunming curați (n = 126), cu o greutate de 25-30 g, au fost furnizați de Centrul pentru animale de laborator din provincia Hebei (licența nr. 911137). Animalele au fost adăpostite în cuști separate, în funcție de sex, la 25 ± 3 ° C, la o umiditate de 55 ± 10% și li s-a permis accesul gratuit la alimente și apă. Protocoalele au fost efectuate în conformitate cu Sugestii de orientare pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, formulate de Ministerul Științei și Tehnologiei din China [25].

Droguri

Extractul de frunze de persimon (flavonoid de frunze de persimmon; conținut: 68%, măsurat prin spectrofotometrie UV; nr. Lot TY20080116) a fost furnizat de Camera de chimie, Colegiul de Medicină Tradițională Chineză Henan, China. Frunzele proaspete sau uscate de caqui din genul Diospyros kaki L.f., au fost achiziționate de la Henan Medical Material Company, Zhengzhou, provincia Henan, China. Frunzele de kaki au fost cântărite, imersate în cantitate de 10 ori cantitatea de etanol 70% (v/v) timp de 2 ore și extrase de două ori, fiecare timp de 1 oră. După filtrare, filtratele au fost combinate și alcoolul a fost îndepărtat. Extractul a fost încărcat pe o coloană de rășină macroporă AB-8, cu o concentrație de lichid de 0,6 g/ml. Volumul rășinii a fost 1: 8; raportul dintre diametrul și înălțimea rășinii a fost 1:10. Probele au fost eluate folosind de patru ori volumul coloanei de apă, urmat de patru ori volumul coloanei de 40% (v/v) etanol. Etanolul (50% (v/v)) a fost utilizat pentru eluarea flavonoidelor. Lichidul de eluare a etanolului a fost colectat, urmat de recuperarea vidului. Probele au fost uscate la 50 ° C.

Metode

Stabilirea și intervenția modelului de toleranță ischemică

Stabilirea modelului de ischemie/reperfuzie: Toți șoarecii au fost anesteziați intraperitoneal cu 10% (greutate/volum) clorhidrat (0,03 ml/10 g). Arterele carotide comune bilaterale au fost expuse, dar fluxul sanguin nu a fost blocat. Când animalele erau conștiente, tuturor șoarecilor li s-a administrat soluție salină intragastrică (0,1 ml/10 g), o dată pe zi, timp de 5 zile consecutive. Doza de flavonoid din frunze de kaki a fost determinată din experimentele anterioare [26]. În ziua 5, după post de 12 ore și 1 oră după administrare, șoarecii au fost anesteziați intraperitoneal cu 10% (greutate/volum) hidrat de clor (0,03 ml/10 g). Arterele carotide comune bilaterale au fost ocluse folosind un microclip pentru a bloca fluxul sanguin timp de 30 de minute, iar apoi a fost permisă reperfuzia [27].

Grupul de chirurgie Sham: s-a efectuat expunerea arterelor carotide comune bilaterale, dar fluxul sanguin nu a fost blocat.

Grup de model de preprocesare: După anestezie, arterele carotide comune bilaterale au fost ocluse cu un micro clip. Precondiționarea ischemică a fost efectuată prin blocarea fluxului sanguin timp de 10 minute. Ulterior, au fost stabilite modele de ischemie/reperfuzie [27].

Grupuri de flavonoide cu frunze de persimmon cu doze mari, moderate și mici și grup de ginaton: șoarecii cu ischemie/reperfuzie au fost supuși condiționării ischemice timp de 10 minute și li s-a administrat ginaton (40 mg/kg, de 15 ori doza clinică), mare (400 mg/kg), moderat (200 mg/kg) și flavonoid din frunze de persimmon cu doză mică (100 mg/kg) (volumul de livrare 4, 40, 20, 10 mg/ml, respectiv), o dată pe zi, timp de 5 zile consecutive zile.

Morfologia cortexului cerebral și a hipocampului la șoareci ischemici

După recoltarea sângelui la 24 de ore de la ultima operație, toți șoarecii au fost eutanasiați. Țesuturile cerebrale au fost obținute rapid, încorporate în parafină, tăiate în secțiuni seriale cu grosimea de 5 μm și colorate cu hematoxilină și eozină. Cortexul cerebral și hipocampul șoarecilor au fost observate la microscopul optic de 400 × (Olympus, Tokyo, Japonia).

Testul imunosorbent legat de enzime detectează fibrinoliza și tromboxanul

Detectarea activatorului plasminogenului de tip tisular și a inhibitorului activatorului plasminogen-1 [28,29]: Sângele a fost colectat la 24 de ore după ultima operație. După anticoagulare cu citrat de sodiu, plasma sanguină a fost separată. În conformitate cu instrucțiunile kitului (activator de plasminogen de tip tisular: Shanghai SUNBIO Co., Ltd., Shanghai, China; lot nr. 41130; inhibitor de activator de plasminogen-1: Beijing Puerweiye Biological Technology Co., Ltd., Centrul de dezvoltare tehnologică Institutul de radioimunitate al General Hospital of Chinese PLA, Beijing, China; lotul nr. 20091125), conținutul activatorului plasminogen de tip tisular și al inhibitorului activatorului plasminogen-1 (ng/mL) au fost detectați.

Detectarea conținutului de tromboxan B2 și 6-ceto prostaglandină-F1 α în modelul ischemic de șoarece: Șoarecii au fost eutanasiați după prelevarea de sânge. Țesuturile cerebrale au fost tăiate coronal pentru colorarea hematoxilinei-eozină. În plus, 15 mg de cortex cerebral au fost omogenizate în nouă ori volumul de ser fiziologic, urmat de centrifugare la 3.500 r/min timp de 10 minute. Supernatantul a fost colectat pentru măsurare. Conform instrucțiunilor kitului (tromboxan B2: Beijing Puerweiye Biological Technology Co., Ltd., Centrul de Dezvoltare a Tehnologiei Institutul Radioimunității al Spitalului General din PLA din China; lotul nr. 20091125), probele au fost testate folosind metoda echilibrului. După ce s-a adăugat proba sau etalonul, s-a adăugat antigenul marcat pentru reacția de legare competitivă. După finalizarea reacției, s-a adăugat un agent de separare imun pentru a izola complexele antigen-anticorp. S-a determinat radioactivitatea (B) a complexelor și s-a calculat rata de legare a tubului standard (B/B0%). Parametrii relevanți, curba de calibrare și concentrația probei au fost obținute direct folosind un program prefabricat folosind un contor gamma [30].

analize statistice

Datele de măsurare au fost exprimate ca medie ± SD și analizate folosind software-ul statistic SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL, SUA). Comparațiile intergrupuri perechi au fost efectuate folosind testul t cu două eșantioane. Datele de rang au fost comparate folosind testul Ridit. A P Blanco M, Lizasoain I, Sobrino T și colab. Precondiționare ischemică: o țintă nouă pentru terapia neuroprotectoare. Cerebrovasc Dis. 2006; 21 (Supliment 2): 38–47. [PubMed] [Google Scholar]