Celule non-neuronale

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Rolul unității neurovasculare în neurodegenerare Vizualizați toate cele 15 articole

Editat de
Eng-King Tan

Institutul Național de Neuroștiințe (NNI), Singapore

Revizuite de
Hajime Hirase

Universitatea din Copenhaga, Danemarca

Farida Hellal

Helmholtz Center München, Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren (HZ), Germania

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

frontierele

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Scurt raport de cercetare ARTICOL

  • 1 Departamentul de Fiziologie și Neuroștiințe, Institutul Neurogenetic Zilkha, Școala de Medicină Keck a Universității din California de Sud, Los Angeles, CA, Statele Unite
  • 2 Departamentul de Neurobiologie, Institutul de Cercetări Biologice, Universitatea din Belgrad, Belgrad, Serbia

Introducere

Funcționarea corectă a creierului depinde de livrarea de oxigen și substanțe nutritive prin intermediul fluxul sanguin cerebral (CBF). Cuplarea neurovasculară, mecanismul unic de control al CBF în creierul mamiferelor, asigură o creștere rapidă a ratei de CBF și de livrare a oxigenului către structurile cerebrale activate (Kisler și colab., 2017a). Pericitele sunt celule murale perivasculare care învelesc capilarele creierului. Acestea sunt poziționate central în cadrul unității neurovasculare, o colecție de diferite tipuri de celule care la nivelul capilarelor creierului include pericite, celule endoteliale, astrocite și neuroni (Kisler și colab., 2017a). Grupul nostru și alții au arătat că pericitele joacă roluri vitale în reglementarea CBF (Bell și colab., 2010; Tachibana și colab., 2018; Nikolakopoulou și colab., 2019; Nortley și colab., 2019), cuplarea neurovasculară (Peppiatt și colab., 2006; Hall și colab., 2014; Biesecker și colab., 2016; Mishra și colab., 2016; Kisler și colab., 2017b; Cai și colab., 2018; Rungta și colab., 2018; Nortley și colab., 2019) și integritatea barierei hematoencefalice (BBB) ​​(Armulik și colab., 2010; Bell și colab., 2010; Daneman și colab., 2010).

Modelele studiate anterior de deficit congenital de pericite se bazează fie pe biodisponibilitatea redusă a factorului de creștere derivat din trombocite endoteliale-B (PDGF-BB; Armulik și colab., 2010; Keller și colab., 2013), fie pe receptorul factorului de creștere derivat din trombocite moștenit la nivel global- Deficiența β (PDGFRβ) în pericite (Bell și colab., 2010; Daneman și colab., 2010; Nikolakopoulou și colab., 2017). Pdgfrb-șoarecii deficienți dezvoltă o pierdere progresivă, dar lentă a pericitului în timp, asociată cu reducerea și dereglarea CBF, ducând în cele din urmă la disfuncție neuronală pe măsură ce îmbătrânesc și poate dura câteva luni până se dezvoltă (Bell și colab., 2010; Kisler și colab., 2017b; Montagne și colab., 2018). Deși am arătat anterior că pierderea moderată de pericite în Pdgfrb șoarecii cu deficit de pericite duc la decuplarea neurovasculară și la scăderea livrării de oxigen premergătoare modificărilor neuronale care apar târziu (Kisler și colab., 2017b), nu este clar dacă a apărut o compensare a dezvoltării în acest model care ar putea contribui la cuplarea neurovasculară aberantă. Folosind un in vivo tehnica de ablație cu laser, un alt studiu a arătat că ablația acută cu pericit unic duce la pierderea temporară localizată a tonusului vascular și dilatarea capilară (Berthiaume și colab., 2018). Cu toate acestea, niciunul dintre aceste studii nu a examinat efectul pierderii rapide și globale a pericitelor cerebrale asupra răspunsurilor hemodinamice, deoarece poate apărea în unele tulburări neurologice acute și cronice (Sweeney și colab., 2018a, b, 2019).

Pentru a dezlega modificările cuplării neurovasculare de aspectele de dezvoltare ale pierderii pericitelor și pentru a determina efectul pierderii globale de pericite acute asupra cuplării neurovasculare, am folosit un model recent dezvoltat de șoarece de ablație specifică pericitului pentru a epuiza rapid pericitele din creierul șoarecilor vii (Nikolakopoulou și colab., 2019). Am emis ipoteza că pierderea rapidă a acoperirii pericitului capilar ar duce la răspunsuri hemodinamice aberante rapide la stimulul neuronal.

Materiale și metode

Animale

Șoarecii au fost adăpostiți în cuști de plastic pe un ciclu de lumină de 12 ore cu ad libitum acces la apă și o dietă standard de laborator. Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din California de Sud, cu instrucțiunile Institutului Național de Sănătate. Animalele de ambele sexe în vârstă de 2-3 luni au fost utilizate în experimente. Toate animalele au fost randomizate pentru informațiile despre genotip. Toate experimentele au fost orbite: operatorii responsabili pentru procedurile experimentale și analiza datelor au fost orbi și nu știau de alocarea grupului pe tot parcursul experimentelor.

Șoarecii Pericyte-CreER, care exprimă recombinaza Cre în mod specific în pericite după tratamentul cu inducție cu tamoxifen (TAM), au fost generați utilizând o abordare cu dublu promotor care combină un construct Pdgfrb-Flp care exprimă recombinaza Flp sub controlul promotorului Pdgfrb (Foo și colab. ., 2006; Cuttler și colab., 2011) și o construcție Cspg4-FSF-CreER care poartă o casetă Frt-Stop-Frt-CreER sub controlul promotorului Cspg4 (Zhu și colab., 2008, 2011), așa cum am descris anterior (Nikolakopoulou și colab., 2019). Acești șoareci au fost încrucișați cu șoareci iDTR (Laboratorul Jackson, Bar Harbor, ME, SUA #: 007900) pentru expresia dependentă de Cre a receptorului toxinei difterice (DT) (DTR; de la simian Hbegf; Buch și colab., 2005) în pericite. Tamoxifenul (TAM) a fost administrat intraperitoneal (i.p) la șoareci (40 mg/kg pe zi) timp de 7 zile pentru a induce expresia DTR. La două săptămâni după terminarea tratamentului TAM, Pericyte-CreER în vârstă de 2-3 luni; Șoarecii iDTR au fost administrați i.p. 0,1 μg DT (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO, SUA # D0564) sau vehicul pe zi timp de 10 zile consecutive, așa cum am raportat anterior (Nikolakopoulou și colab., 2019). Animalele au fost studiate în ziua 0, 3, 6 și 9 a tratamentului DT sau a vehiculului, inclusiv fluxmetria cu laser doppler (LDF), imagistica semnalului intrinsec optic (IOS) și acoperirea pericitului) și la 3 zile după DT sau vehicul (LDF, IOS ) imagistică, acoperire pericite, răspuns neuronal prin colorare sensibilă la tensiune (VSD), densitate vasculară).

Imunohistochimie

Pentru a determina acoperirea pericitului, s-au reconstituit z-stive maxime de proiecție de 10 μm (suprafața 640 × 480 μm), iar zonele ocupate de semnale fluorescente CD13-pozitive (pericite) și lectine-pozitive (endoteliu) pe vasele 3 ale țesutului cerebral.

Fereastra craniană

Ferestrele craniene au fost implantate așa cum s-a descris anterior (Kisler și colab., 2017b, 2018). Pe scurt, animalele au fost inițial anesteziate cu 100 mg/kg de ketamină și 10 mg/kg de xilazină și au fost plasate pe un tampon de încălzire (37 ° C). Craniul mouse-ului a fost fixat ferm într-un cadru stereotaxic (Kopf Instruments, Tujunga, CA, SUA). Un burghiu dentar de mare viteză (tip FST 19007-05, Fine Science Tools Inc., Foster City, CA, SUA) a fost folosit pentru a delimita o fereastră craniană cu diametrul de aproximativ 5 mm peste cortexul somatosenzorial și forcepsele de 45 ° scoate bucata de craniu. Gelfoam (Pharmacia și Upjohn Company, Kalamazoo, MA, SUA) a fost aplicat imediat pentru a controla orice sângerare craniană sau durală. O lamelă de sticlă sterilă de 5 mm a fost așezată apoi pe dura mater și sigilată cu clei pe bază de cianoacrilat.

Debimetrie cu laser Doppler (LDF)

Răspunsurile CBF la stimularea membrelor posterioare la șoareci anesteziați (izofluran 1%) au fost determinate folosind fluxmetria laser-Doppler măsurată printr-o fereastră craniană. Tipul sondei laser-Doppler (Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, SUA) a fost plasat stereotaxic la 0,5 mm deasupra ferestrei craniene. CBF a fost înregistrat din regiunea membrului posterior al cortexului somatosenzorial după stimularea electrică a membrului posterior utilizând un stimul de 60 s (7 Hz, durata pulsului de 2 ms). Creșterea procentuală a CBF datorită stimulării a fost obținută prin scăderea CBF inițială din valoarea maximă atinsă în timpul stimulului și a fost calculată în medie pe trei studii pe șoarece. Pentru răspunsul CBF la aplicarea acetilcolinei, sonda LDF a fost plasată stereotaxic peste centrul unei ferestre craniene deschise (centrul la AP = -1,5 mm, L = 2 mm). Acetilcolina (10 μM, Sigma - Aldrich, St. Louis, MO, SUA) a fost suprapusă peste fereastra deschisă și răspunsurile au fost înregistrate, așa cum am raportat anterior (Kisler și colab., 2017b; Nikolakopoulou și colab., 2019).

Imagine intrinsecă a semnalului optic (IOS)

IOS-urile au fost imaginate printr-o fereastră craniană peste regiunea membrului posterior în cortexul somatosenzorial, așa cum am descris anterior (Kisler și colab., 2017b, 2018). Sub anestezie cu izofluran setat la 1%, imaginile au fost capturate la 30 ms/cadru folosind o cameră de 1/2 inch CCD MiCAM02-HR (SciMedia; 2 × binned la rezoluție 184 × 124-pixel; 1 pixel = 16,5 μm) cu BV_ANA însoțitoare software de achiziție. Imaginile au fost capturate sub o sursă de lumină LED verde de 530 nm și colectate printr-un filtru bandpass de 522/36 nm (Chroma). Membrul posterior contralateral a fost stimulat de o scurtă vibrație mecanică de 300 ms. Seturile de imagini rezultate au fost filtrate cu trecere joasă la 2 Hz, iar liniile de bază au fost corectate pentru orice deriva folosind software-ul BV_ANA. Cursurile de timp ale semnalului au fost evaluate folosind ROI-uri pe rază de 10 pixeli alese în regiunea de schimbare a semnalului de vârf, astfel încât regiunile să nu includă vase mari vizibile și să fie la cel puțin 30 μm distanță de orice nave mari. Cursurile de timp au fost reprezentate grafic folosind Igor Pro 6 și analizate cu Igor Pro 6 și GraphPad Prism 8. Imaginile pseudocolore pentru prezentare au fost generate în ImageJ.

Imagerie cu colorant sensibil la tensiune (VSD)

Analize statistice

Mărimile eșantioanelor au fost calculate utilizând nQUERY presupunând un nivel alfa față-verso de 0,05, 80% putere și varianțe omogene pentru eșantioanele care urmează să fie comparate, cu mediile și abaterea standard comună pentru diferiți parametri estimate pe baza studiilor noastre anterioare (Kisler et. al., 2017b; Nikolakopoulou și colab., 2017, 2019; Montagne și colab., 2018). Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Pentru comparație între două grupuri, an F-testul a fost efectuat pentru a determina similaritatea diferențelor dintre grupurile care sunt comparate statistic, iar semnificația statistică a fost analizată de studenții cu două cozi testul t. Pentru comparații multiple, testul Brown - Forsythe a fost utilizat pentru a determina similaritatea diferențelor dintre grupuri și analiza unică a varianței (ANOVA) urmată de Bonferroni sau Tukey’s post hoc testul a fost utilizat așa cum este indicat în legende pentru a testa semnificația statistică, utilizând software-ul GraphPad Prism 8. A P-valoarea mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă statistic. Coeficientul și semnificația de corelație Pearson au fost calculate utilizând un test cu două cozi în software-ul GraphPad Prism 8.

Rezultate

Pentru a studia efectul pierderii de pericite acute și globale asupra cuplării neurovasculare, am folosit recent dezvoltată linia de șoarece Cre inductibilă specifică pericitului (pericit-CreER; Nikolakopoulou și colab., 2019) traversată la șoareci iDTR care poartă receptor de toxină difterică umană dependentă de Cre (DTR; Buch și colab., 2005; pericyte-CreER; iDTR), așa cum am raportat anterior (Nikolakopoulou și colab., 2019). Tratamentul pericitului-CreER; Șoarecii iDTR cu tamoxifen (TAM) induc expresia DTR în mod specific în pericite (și nu în alte tipuri de celule), iar tratamentul ulterior cu DT duce exclusiv la moartea celulelor pericite, după cum sa raportat anterior (Nikolakopoulou și colab., 2019). Deficiențele în cuplarea neurovasculară au fost evaluate prin imagistica LDF și IOS a răspunsurilor CBF la stimulul membrelor posterioare la 0, 3, 6 și 9 zile de tratament DT sau vehicul și la 3 zile după DT sau vehicul (Figura 1A). Acoperirea pericitelor a fost determinată la 0, 3, 6 și 9 zile de tratament DT și la 3 zile după DT sau vehicul, în timp ce măsurătorile VSD ale răspunsurilor potențiale ale membranei evocate neuronale și ale densității capilare corticale au fost evaluate la 3 zile după DT sau tratamentul vehiculului (Figura 1A).

figura 1. Ablația pericitelor corticale din creierul adult al șoarecelui duce la dereglarea acută a cuplării neurovasculare. (A) O diagramă a protocolului de injecție a pericitului-CreER; Șoareci iDTR cu tamoxifen (TAM; 40 mg/kg zilnic timp de șapte zile consecutive), toxină difterică (DT; 0,1 μg pe zi timp de 10 zile consecutive) sau vehicul, și momentele în care răspunsul fluxului sanguin cerebral (CBF) la stimul a fost măsurat s-au efectuat măsurători prin fluxmetrie laser Doppler (LDF) și semnal optic intrinsec (IOS), răspuns neuronal la stimul și măsurători ale densității capilare. (B) Imagini reprezentative de microscopie confocală a acoperirii pericite CD13-pozitive a profilurilor endoteliale lectin-pozitive în regiunea membrului posterior al cortexului S1 la 3, 6 și 9 zile de administrare DT sau vehicul și la 3 zile după DT sau vehicul Bară = 20 μm. (C) Cuantificarea pierderii de acoperire a pericitelor pe capilare (Cuvinte cheie: cuplare neurovasculară, ablație acută a pericitelor, flux sanguin cerebral, capilar, fluxmetrie cu laser doppler, imagistică a semnalului optic intrinsec, imagistică colorant sensibilă la tensiune

Citație: Kisler K, Nikolakopoulou AM, Sweeney MD, Lazic D, Zhao Z și Zlokovic BV (2020) Ablația acută a pericitelor corticale duce la decuplarea neurovasculară rapidă. Față. Celulă. Neuroști. 14:27. doi: 10.3389/fncel.2020.00027

Primit: 26 octombrie 2019; Acceptat: 29 ianuarie 2020;
Publicat: 14 februarie 2020.

Eng-King Tan, Institutul Național de Neuroștiințe (NNI), Singapore

Hajime Hirase, Universitatea din Copenhaga, Danemarca
Farida Hellal, Institutul pentru Cercetarea AVC și Demență (ISD), Germania

* Corespondență: Berislav V. Zlokovic, [email protected]

† Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare și împărtășesc prima autorie