1 Filiala Boli Digestive, Institutul Național de Diabet și Boli Digestive și Rinice, Institutele Naționale de Sănătate, Bethesda, Maryland 20892-1804

receptorii

Abstract

Familiile de peptide CCK și gastrină acționează ca hormoni și neuropeptide pe receptorii centrali și periferici pentru a media secreția și motilitatea tractului gastro-intestinal în răspunsul fiziologic la o masă normală. Până în prezent, doi receptori CCK au fost identificați molecular pentru a media acțiunile CCK și gastrinei, receptorii CCK-A și CCK-B (CCK-AR și, respectiv, CCK-BR). Reglarea afinității CCK-AR și CCK-BR de către nucleotidele de guanină și activarea receptorilor de stimulare dependentă de proteina G a fosfolipazei C și adenilil ciclazei a sugerat că aceștia erau receptori cuplați la proteine ​​care leagă nucleotidele de guanină [receptori cuplați la proteina G (GPCRs) )]; cu toate acestea, eventuala clonare a ADNc-urilor lor a dezvăluit structura heptahelică și a confirmat apartenența lor la superfamilia GPCR. Sistemul gastrointestinal este o sursă bogată de hormoni neuroendocrini care interacționează cu un număr mare de GPCR pentru a regla sarcinile complexe de digestie, absorbție și excreție a unei mese. Acest articol se concentrează pe familia CCK de GPCR-uri și activitățile sale în sistemul gastro-intestinal.

FIG. 1.Structura CCK, gastrină și agoniști și antagoniști nonpeptidici selectivi subtip. A: secvența primară a celor mai predominante forme de mamifere ale CCK: CCK-58, CCK-33 și CCK-8. B: formă sulfatată majoră de gastrină (~ 50% sulfatată), gastrină-17-II

Tabelul 1. Caracteristicile celor două subtipuri majore de receptori CCK

Receptorii CCK-AR și CCK-BR, CCK-A și CCK-B. IP, fosfat de inozitol; DAG, diacilglicerol; CCK-8, octeceptidă de colecistochinină; PLC, fosfolipază C; Proteina G, proteina reglatoare care leagă nucleotidele de guanină; A-71378, [des-amino, Nle 28,31,N-metil-Asp 32] CCK- (27-33); SNF-8702, [N-metil-Nle 28,31] CCK- (26-33).

Tabelul 2. Localizarea și funcția subtipurilor de receptor CCK

SNC și SNP, sistemele nervoase centrale și periferice; SMS, somatostatină; GI, gastro-intestinal; ECL, de tip enterocromafină; s. mușchi, mușchi neted; ca., carcinom. Săgețile indică direcția schimbării funcției mediată de subtip.

După donarea CCK-BR umană, o căutare a expresiei tisulare neapreciate anterior a CCK-BR prin hibridizare Northern blot a dezvăluit o expresie relativ ridicată în rinichi. Deși s-a emis ipoteza de mai mulți ani că hormonii gastro-intestinali, cum ar fi gastrina, care devin crescuți ca răspuns la o masă joacă un rol semnificativ în reglarea acută a manipulării renale a nutrienților absorbiți, hormonii reali implicați, precum și locul și mecanismul lor de acțiune au rămas evazive. Pisegna și colab. (17) descrie distribuția CCK-BR către tubulii proximali în rinichi prin imunohistochimie și RT-PCR într-un model compatibil cu această funcție integrativă. Creșterea gastrinei serice la șobolani fie prin stimularea unei mese gavate, fie prin infuzie de doze fiziologice a dus la o creștere de patru ori a excreției urinare de Na + și a excreției fracționate de Na + și la o creștere de opt ori a debitului de urină care ar putea fi inhibat de CCK-BR- antagonist specific L-365.260. Studiile lui Pisegna și colab. (17) oferă, pentru prima dată, dovezi directe pentru hormonii gastro-intestinali ca mediatori ai axei gastro-intestinale-renale și au implicații profunde în înțelegerea influenței alimentării asupra funcției renale.

FIG. 2.Modele schematice ale războiului CCK-AR (A) și CCK-BR (B). Secvențe de aminoacizi primare deduse de CCK-AR și CCK-BR de șobolan care prezintă helici transmembranare putative, situsuri de glicozilare legate de NH2 (tridente), site-uri de fosforilare a protein kinazei C și protein kinazei A (-PO3), potențial punte disulfură (-SS-) între cisteine ​​conservate în prima și a doua buclă extracelulară și o potențială palmitoilată (linie zimțată) cisteină conservată în coada citoplasmatică (-NH2, capătul amino; -COOH, capătul carboxi). •, Reziduuri conservate (identice) între CCK-AR și CCK-BR (27).

Dezvoltarea testelor radioimunologice, a radioligandilor cu eficacitate și potență deplină, a imunocitochimiei și, mai recent, a agoniștilor și antagoniștilor specifici subtipului receptorului a accelerat foarte mult descoperirile în endocrinologia gastro-intestinală. Din distribuția receptorilor CCK descrisă mai sus este clar că multe țesuturi și chiar celule unice exprimă atât CCK-AR, cât și CCK-BR și că gastrina este singurul agonist selectiv nativ. Prin urmare, recent disponibil agonistul CCK-AR selectiv, A-71378 și CCK-AR și CCK-BR subtip selectiv substituit cu antagoniști de 1,4-benzodiazepine, cum ar fi L-364,718 și respectiv L-365,260 (Fig. 1), au fost extrem de utile în sortarea locației și funcțiilor fiziologice atribuite fiecărui subtip de receptor (4). Utilitatea L-365.260 a fost limitată de selectivitatea relativ scăzută pentru CCK-BR vs. CCK-AR (de 80 până la 280 de ori în funcție de specie și chiar o inversare a afinității la canini) și activitatea sa agonistă parțială. Recent, a fost dezvoltat un antagonist de benzodiazepine de a doua generație, L-740.093 (Fig. 1), cu afinitate mai mare (IC50 = 0,1 nM pentru secreția acidă), selectivitate mai mare (de 16.000 de ori) pentru CCK-BR și o solubilitate apoasă îmbunătățită. 15).

Rozătoarea Mastomys natalensis, cu o predispoziție genetică spre dezvoltarea carcinoidelor gastrice de origine ECL, a servit ca model pentru studierea potențialului neoplazic al hipergastrinemiei care acționează la ECL CCK-BR. Hipergastrinemia accelerează dezvoltarea Mastomys carcinoide gastrice în care celulele ECL au o expresie crescută a CCK-BR comparativ cu celulele ECL native. Această asociație a determinat o investigație suplimentară asupra posibilului rol de promovare a creșterii CCK-BR în transformarea celulelor ECL (12). Schaffer și colab. (21) a demonstrat recent un nivel bazal mai ridicat de semnalizare independentă de agonistMastomys CCK-BR în celulele COS transfectate comparativ cu CCK-BR uman, datorită unui polimorfism al speciilor cu patru aminoacizi din al șaselea domeniu transmembranar, sugerând un posibil mecanism care contribuie la baza propensiuniiMastomys pentru a dezvolta carcinoizi gastrici. Dacă aceste rezultate sunt aplicabile bolilor umane este incert; cu toate acestea, hipergastrinemia, cauzată fie de aclorhidrie, fie de sindromul sporadic Zollinger-Ellison, are ca rezultat rareori carcinoizi ECL.

GPCR-urile sunt activate de un grup chimand divers de liganzi, în ciuda asemănării lor structurale generale. Din păcate, deoarece GPCR-urile sunt proteine ​​membranare integrale, generarea de cristale de înaltă calitate necesare pentru analiza structurală detaliată cu raze X pentru a explica această diversitate observată nu a reușit până acum. Cu toate acestea, folosind structura criomicroscopică electronică de rezoluție redusă a rodopsinei și compararea secvenței a mai mult de 200 GPCR, a fost propus un model general de lucru de orientare elicoidal transmembranară, ambalare și aliniere (1), iar utilitatea caracteristicilor sale de bază a fost confirmată de o serie de studii mutaționale genetice biochimice și moleculare. Din acest model, s-a stabilit că aproape toți aminoacizii care interacționează cu ligandii mici sunt orientați spre fanta centrală, hidrofilă a receptorului. Deși caracteristicile structurale ale miezului transmembranar al receptorului devin mai clare, structura suprafeței extracelulare mai variabile și mai puțin ordonate a GPCR-urilor rămâne neclară. Se crede că liganzii peptidici interacționează cu aminoacizii din partea superioară a domeniilor transmembranare și în buclele extracelulare mai puțin bine caracterizate ale GPCR-urilor (3).

Un studiu care a examinat 58 de receptori himerici, în care unul până la patru aminoacizi divergenți din domeniul transmembranar al CCK-BR au fost înlocuiți cu aminoacizii corespunzători din CCK-AR, a identificat doar un singur reziduu, Ser 131, în partea de sus a TM III, conferind selectivitate de aproximativ șase ori subtip pentru gastrina peptidică agonistă vs. CCK-8 (9).

Studii elegante care au examinat capătul extracelular NH2 al CCK-AR, utilizând mai întâi o trunchiere terminală NH2 42-aminoacidă a CCK-AR umană și ulterior mutanți direcționați către sit în regiunea din apropierea vârfului TM I, au sugerat interacțiunea dintre resturile de aminoacizi Trp 39 și Gln 40 cu CCK (Fig. 2). Legarea ulterioară între CCK-AR mutant de tip sălbatic, Trp 39-Phe și Gln 40 -Asn și o serie de analogi CCK modificați terminal NH2 care au fost aplicați unui model de CCK-AR (pe baza datelor din bacteriorodopsină, rodopsină și receptorii β-adrenergici) au sugerat că porțiunea NH2-terminală a CCK-8 interacționează prin legarea hidrogenului la Trp 39 și Gln 40 (6).

Interacțiunea CCK cu CCK-AR a fost modelată în continuare într-un studiu (24) care descrie mutațiile separate de aminoacizi ale Lys 105 -Val și Arg 337 -Val (Fig. 2) în CCK-AR exprimate în celulele CHO care a dus la o pierdere a eliberării de Ca 2+ stimulată de CCK-8. Pierderea eliberării de Ca 2+ în celulele care exprimă CCK-AR Lys 105 -Val și Arg 337 -Val a fost atribuită pierderii interacțiunii cu CCK la Tyr (SO3H) 52 și Asp 57 (Fig. 1; CCK-58), respectiv (24).

Un studiu al șobolanului CCK-BR folosind CCK-AR/CCK-BR șomer pentru a determina baza structurală a selectivității subtipului CCK-BR pentru gastrină vs. CCK-8 a identificat importanța celei de-a doua bucle extracelulare. Mutageneza dirijată la locul celei de-a doua bucle extracelulare a sugerat că un segment de cinci aminoacizi (lângă Cys 205, care formează putativ o punte disulfură cu Cys 127 în partea superioară a TM III) (Fig. 2) a fost important pentru selectivitatea gastrinei (19). ). Studiile chimerice independente umane CCK-AR/CCK-BR, bazate pe amestecarea exonului genelor receptorilor respectivi, au demonstrat, de asemenea, importanța acestei zone în apropierea vârfului TM III pentru conferirea unei afinități mari de gastrină (32).

NOTĂ DE PICIOASĂ

* În primul rând dintr-o serie de articole invitate despre receptorii cuplați la proteine ​​G în fiziologia gastrointestinală.

REFERINȚE

NOTE AUTORULUI

Adresați cererile de reimprimare către Bldg. 10, Rm. 9C103, Institutele Naționale de Sănătate, Bethesda, MD 20892-1804.