Yasemin likelik ALTUNOĞLU

1 Departamentul de Genetică și Bioinginerie, Facultatea de Inginerie și Arhitectură, Universitatea Kastamonu, Kastamonu, Turcia,

pepene

Merve KELEȘ

1 Departamentul de Genetică și Bioinginerie, Facultatea de Inginerie și Arhitectură, Universitatea Kastamonu, Kastamonu, Turcia,

Tevfik Hasan CAN

1 Departamentul de Genetică și Bioinginerie, Facultatea de Inginerie și Arhitectură, Universitatea Kastamonu, Kastamonu, Turcia,

Mehmet Cengiz BALOĞLU

1 Departamentul de Genetică și Bioinginerie, Facultatea de Inginerie și Arhitectură, Universitatea Kastamonu, Kastamonu, Turcia,

Abstract

1. Introducere

Citrillus lanatus (pepene verde) este o plantă importantă din familia Cucurbitaceae, constituind 7% din totalul câmpurilor mondiale dedicate producției de culturi. Producția anuală mondială de pepene verde (Citrillus lanatus) este de aproximativ 90 de milioane de tone, iar pepenele verde (Citrillus lanatus) se numără printre cele mai consumate 5 fructe proaspete (FAO, u1d42). Deși pepenele verde (Citrillus lanatus) este compus în mare parte din apă (până la 90%), acesta conține compuși nutritivi importanți, cum ar fi zahărul, licopenul și aminoacizii care promovează sănătatea, inclusiv citrulina, arginina și glutationul (Hayashi și colab., 2005; Perkins-Veazie și colab., 2006; Collins și colab., 2007; Guo și colab., 2013).

Proteinele de șoc termic (Hsps) sunt o familie specială de proteine ​​care sunt sintetizate ca răspuns la o varietate de condiții de stres, inclusiv temperaturi ridicate, și sunt necesare pentru creșterea și supraviețuirea celulei (Whitley și colab., 1999; Kumar și colab., 2012; likelik Altunoğlu, 2016). Hsps sunt funcționale în multe procese, cum ar fi plierea proteinelor, reglarea celulară și inhibarea acumulării de proteine ​​inadecvate în celulă. În plus, membrii acestei familii de proteine ​​sunt cunoscuți a fi sintetizați în condiții de stres diferite și se comportă ca chaperone moleculare, care permit proteinelor să devină structură tridimensională prin pliere (Henle și colab., 1998). Ele sunt, de asemenea, determinanți cheie ai controlului calității și au un rol important în protejarea echilibrului global al proteinelor celulare (Kumar și colab., 2012).

Datele genomice complete ale organismelor sunt utile pentru determinarea familiilor de gene importante folosind metode bioinformatice. Hsps au fost caracterizate în multe specii de plante, inclusiv Arabidopsis (Swindell și colab., 2007), grâu (Muthusamy și colab., 2017), floarea-soarelui (Büyük și colab., 2012), orez (Singh și colab., 2010; Jiang și colab., 2014; Wang și colab., 2014), roșie (Zai și colab., 2017), plop (Yer și colab., 2016; Yer și colab., 2018) și eucalipt (Altunoğlu, 2016). Secvența completă a genomului de pepene verde a fost publicată de Guo și colab. în 2013; cu toate acestea, din câte știm, membrii familiei Hsp nu au fost încă definiți în genomul pepenelui verde. În studiul actual, genele Hsp de pepene verde au fost identificate și caracterizate. În plus, profilurile de expresie ale genelor în condiții combinate de secetă și stres termic au fost analizate experimental și rezultatele au fost comparate folosind bioinformatica.

2. Materiale și metode

2.1. Identificarea genelor proteinelor de șoc termic (hsp) în genomul pepenelui verde

Conform studiului publicat anterior (Baloğlu, 2014b; Baloğlu, 2014c; Kavas și colab., 2015; Kavas și colab., 2016), s-au efectuat diferite strategii de căutare pentru a elucida genele Hsp din genomul pepenei verzi. În primul rând, folosind baza de date HSPIR (Resurse de informații privind proteina șocului termic), genomica, regiunea de codificare și secvențele proteice ale genelor Hsp au fost obținute pentru toate plantele. Pentru aceste secvențe, a fost efectuată o căutare BLASTP (Protein Blast Sequence Comparison) folosind baza de date Cucurbit Genomics. În plus, secvențele definite au fost scanate și selectate în funcție de regiunile protejate utilizând Modelul Hidden Markov (HMM). Regiunile protejate ale secvențelor selectate au fost verificate cu baza de date Pfam (https://pfam.xfam.org/) și au fost recuperate pentru studiu ca pepene verde. Indicele de instabilitate, greutățile moleculare și valorile efectului izoelectronic (pI) ale acestor secvențe Hsp au fost obținute folosind instrumentul ProtParam (u1d45).

2.2. Determinarea localizărilor cromozomiale și estimarea structurii genice a hsps

Localizările cromozomiale ale genelor Hsp găsite în plantele de pepene verde au fost realizate folosind baza de date Cucurbit Genomics (u1d46); aceste localizări au fost apoi afișate pe cromozomi cu programul MapChart. Pentru a clarifica structura genelor Hsp de pepene verde, regiunile exon - intron ale genelor au fost determinate utilizând Gene Structure Display Server (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) (Hu și colab., 2015 ).

2.3. Alinierea secvenței, analiza filogenetică și identificarea motivelor conservate

Alinierea secvenței multiple a pepenei Hsps definit a fost realizată folosind ClustalW prin intermediul programului MEGA7. Arborii filogenetici au fost desenați folosind secvențe aliniate cu programul ClustalW. Metoda de maximă probabilitate (Milligan, 2003) a fost utilizată atunci când a fost desenat arborele filogenetic. Prin această metodă, s-a format un copac filogenetic cu 1000 de analize de bootstrap repetitive. Arborele filogenetic desenat a fost vizualizat folosind baza de date iTOL și fiecare cluster a fost indicat într-o culoare diferită. Portalul web MEME Suit (Bailey și colab., 2015) a fost utilizat pentru a identifica motivele păstrate. Când a fost definit, numărul motivelor a fost 20 și lățimea motivului a fost aleasă ca optimă ≥2 și ≤300. Motivele obținute au fost, de asemenea, scanate folosind baza de date InterPro cu InterProScan (Quevillon și colab., 2005).

2.4. Analize ontologice genetice

Programul Blast2Go a fost utilizat pentru analiza funcțională a anumitor Hsps de pepene verde (Conesa și Götz, 2008). S-au încărcat secvențele de aminoacizi ale pepenelui Hsps, iar funcțiile biologice și moleculare și conținutul celular au fost obținute prin clasificare GO urmând pași precum BLAST, interpro, cartografiere, adnotare, graficare și graficare.

2.5. Calculul ratelor de modificare omoloage și neomoloage

Alinierea multiplă a secvenței de aminoacizi a fost realizată prin programul ClustalW prin alinierea perechilor de gene ortoloage între genele Hsp duplicate în genomul pepene verde și Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Glycine max, Populus trichocarpa, Vitis vinifera și Zea mays. Ulterior, ratele de schimb omoloage (Ks) și nonhomologous (Ka) au fost calculate folosind programul PAL2NAL printr-o metodă care aliniază secvențele de aminoacizi ale genelor Hsp cu secvențele lor originale de ADN complementare (Suyama și colab., 2006). Astfel, pentru fiecare genă Hsp, duplicările și timpul de separare (cu milioane de ani în urmă, MYA) au fost calculate utilizând raporturi de mutație omoloage ale modificărilor λ corespunzătoare fiecărei regiuni și ani omoloage (T = Ks/2λ (λ = 6,5 × 10-9)) Lynch și Conery, 2000; Yang și colab., 2008).

2.6. Modelarea omologică a PSS

A fost efectuată o scanare Protein Data Bank (PDB) pentru a identifica secvențele similare cu proteinele Hsp de pepene verde și cea mai potrivită probă cu o structură tridimensională cunoscută utilizând BLASTP (Berman și colab., 2000). Posibile structuri tridimensionale ale pepenelui Hsps au fost analizate utilizând programul Phyre2 cu datele obținute (Kelley și colab., 2015).

2.7. Identificarea miARN-urilor vizate genelor hsp din pepene verde

Baza de date miARN de plante a fost utilizată pentru a identifica miARN-uri care vizează gene de miARN de plante cunoscute anterior folosind programul miRBase v20.0 (http://www.mirbase.org/) pentru identificarea țintelor genetice controlate de miARN (Budak și Akpinar, 2015) . Toți miARN-urile de plante și pepene verde au fost identificate prin alinierea tuturor miARN-urilor de plante cunoscute cu transcrierile genei Hsp din planta de pepene verde folosind serverul țintă psRNA (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/home) (Dai și Zhao, 2011).

2.8. Determinarea profilurilor de expresie ale genelor hsp de pepene verde folosind date transcriptomice

Pentru analiza RNA-Seq, toate citirile Illimuna HiSeq au fost furnizate printr-o arhivă de baze de date deschisă numită SRA (Sequence Read Archive). Numere de acces: SRR1724899, SRR1724900, SRR1724901, SRR1724902, SRR1724903, SRR1724943 (10, 18, 26, 34, 42 și 50 de zile carne de fructe colectate după polenizare, respectiv), WM-UR-1/SRR1001435, WM-UR-2/SRR1001436 (fruct alb la 10 zile după polenizare), WM-IM-1/SRR1001437, WM-IM-2/SRR1001438 (fruct alb - roz la 18 zile după polenizare), WM-PM-1/SRR1001439, WM-PM-2/SRR1001440 (fruct roz la 28 de zile după polenizare), WM-MA-1/SRR1001441, WM-MA-2/SRR1001442 (fruct roșu copt 34 de zile după polenizare), SRR494474, SRR518988, SRR518988 (țesut floem), SRR494479, SRR518992, SRR518993 (țesuturi vasculare). Datele secvenței brute „.sra” ale tuturor citirilor au fost descărcate și convertite în formatul „fastq” folosind comanda fastq-dump a NCBI SRA Toolkit. Analiza FastQC a fost efectuată pentru a efectua controlul calității asupra tuturor citirilor rămase pentru a elimina cele de calitate scăzută din citirile obținute. Normalizarea și transformarea tuturor citirilor au fost efectuate cu programul CLC Genomic Workbench versiunea 11.1. O hartă ierarhică de grupare (HeatMap) a fost desenată folosind măsurători ale expresiei genelor cu programul Permut Matrix.

2.9. Cultivarea plantelor de pepene verde și aplicații de stres

2.10. Izolarea ARN și analiza PCR în timp real

2.11. analize statistice