Eirin Carolan, Andrew E. Hogan, Michelle Corrigan, Gadintshware Gaotswe, Jean O'Connell, Niamh Foley, Luke A. O'Neill, Declan Cody, Donal O'Shea, The Impact of Childhood Obesity on Inflammation, Innate Immune Cell Frequency, și Metabolic MicroRNA Expression, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, Volumul 99, Ediția 3, 1 martie 2014, Pagini E474 - E478, https://doi.org/10.1210/jc.2013-3529

impactul

Obezitatea se caracterizează prin inflamație cronică, dereglare imună și alterarea expresiei genelor, asociate cu diabetul zaharat de tip 2 și bolile cardiovasculare. Gradul în care apar aceste modificări în obezitatea infantilă nu este pe deplin definit.

Scopul a fost investigarea efectului obezității copiilor asupra frecvenței celulelor imune, activarea macrofagelor, producția de citokine și regulatori specifici ai expresiei genetice metabolice. Profilarea a fost efectuată pe sânge periferic de la 29 de copii obezi și 20 de copii neobezi folosind PCR în timp real, ELISA și citometrie de flux.

Glucoza la jeun a fost similară în ambele grupuri, dar a existat un grad mai mare de rezistență la insulină la subiecții obezi (model de homeostazie de evaluare a rezistenței la insulină, 4,8 vs 0,84; P

Obezitatea este asociată cu dezvoltarea unor comorbidități metabolice grave, inclusiv boli cardiovasculare premature și diabet zaharat de tip 2 (T2DM).

Impactul greutății asupra sistemului imunitar și metabolic este acum considerat a fi un proces bidirecțional dinamic. Modificările sistemului imunitar la obezitatea la adulți sunt bine descrise, dar impactul obezității la copii asupra stării imune a fost mai puțin bine studiat și este centrul acestei lucrări.

Inflamația stă la baza multor comorbidități legate de obezitate. Citokinele proinflamatorii sunt supraexprimate la obezitatea adultă și sunt legate de sindromul metabolic (1). Profiluri proinflamatorii similare au fost descrise la copii, cu raportări de proteină C reactivă crescută la copiii obezi cu vârsta de până la 3 ani (2-4). S-a observat că parametrii inflamatori, cum ar fi IL-6, IL-8, IFN-γ, TNF-α, proteina chimiotratantă monocitară-1 și monocitele activate, au fost crescute, iar adipokina antiinflamatoare, adiponectina, a fost redusă în obezi comparativ cu copiii cu greutate normală (4-7).

Macrofagele joacă un rol distinct în rezistența la insulină indusă de obezitate și contribuie major la inflamația țesutului adipos (8). La subiecții sănătoși, macrofagele sunt celule M2 reglatoare care produc citokina anti-inflamatorie IL-10. În obezitate, macrofagele sunt polarizate către fenotipul inflamator M1, producând citokina pro-inflamatorie IL-1β. Pe măsură ce macrofagele devin proinflamatorii, îndepărtarea receptorului de haptoglobină-hemoglobină CD163 devine reglată în sus și este măsurabilă ca CD163 solubil (sCD163). sCD163 este puternic asociat cu rezistența la insulină, independent de parametrii inflamatori, cum ar fi TNF-α (9). Recent am identificat un rol pentru celulele iNKT în reglarea greutății și a metabolismului la obezitatea adultă (10). Epuizarea celulelor iNKT la șoarecii obezi este asociată cu proliferarea macrofagelor adipoase M1 (10).

Această rețea de adipozitate, dereglare a celulelor imune și inflamație este interconectată cu metabolismul acizilor grași și semnalizarea insulinei. Am ales să studiem trei regulatori critici ai genelor în amonte de aceste căi metabolice. MicroARN-urile (miR-urile) sunt ARN-uri mici, necodificate, care modifică expresia genei țintă post-transcripționale și sunt puternic asociate cu boli metabolice la modelele murine și la oamenii adulți (11). MiR-33a și MiR-33b sunt exprimate în mai multe țesuturi, inclusiv macrofage și proteina țintă de legare a elementelor de reglare a sterolului, care reglează homeostazia lipidelor și a colesterolului (12). MiR-107 reglează sensibilitatea la insulină vizând proteinele din membrana plasmatică caveolae, reducând numărul receptorilor de insulină și afectând negativ semnalizarea insulinei din aval (13, 14). Creșterea expresiei miR-107 a fost descrisă la populațiile adulte obeze rezistente la insulină.

Acest studiu investighează nivelurile sCD163, frecvența circulantă a celulelor iNKT, profilul citokinelor și expresia miR la copiii obezi și neobezi.

Subiecte și metode

Studiați cohorte

Aprobarea etică a fost acordată de Comitetul de Etică, Spitalul de Copii al Doamnei, Dublin, Irlanda. Părinții tuturor pacienților au dat consimțământul scris în cunoștință de cauză.

Au fost recrutați patruzeci și nouă de copii (29 obezi, 20 neobezi) cu vârsta cuprinsă între 6-18 ani. Subiecții au fost clasificați ca obezi sau nonobezi utilizând diagramele centile ale Indiciului de masă corporală (IMC) pentru obezitate. IMC a fost calculat ca greutate (kilograme)/înălțime (metri) 2. Nivelurile de insulină (picomoli/litru), glucoză (milimoli/litru) și colesterol (milimoli/litru) au fost măsurate după un post de 12 ore. A fost efectuat un examen clinic la toți participanții și s-a finalizat un istoric detaliat care cuprinde istoricul medical trecut, starea de sănătate actuală, numărul și severitatea infecțiilor anterioare, apariția infecției recente și utilizarea medicamentelor antiinflamatorii. Au fost excluși copiii cu deficiență hormonală, tulburări genetice, afecțiuni inflamatorii sau apariția unei infecții acute recente.

Analiza celulelor mononucleare serice și periferice (PBMC)

Probele PBMC au fost izolate prin centrifugare cu densitate așa cum s-a descris anterior (10). Celulele au fost cultivate în triplu timp de 24 de ore numai în medii, medii cu lipopolizaharidă (LPS) (10 μg/mL) sau medii cu acetat de mirorat de forbol (10 ng/ml) și ionomicină (5 μg/ml). Serurile și supernatantele celulare au fost analizate pentru nivelurile de citokină, adipokină și sCD163 prin ELISA.

Analiza citometrică de flux

PBMC au fost colorate pentru celulele iNKT folosind anticorpi monoclonali BD (6B11/CD3, BD Biosciences), așa cum s-a descris anterior (14). Celulele au fost analizate folosind software-ul FlowJo. Celulele au fost închise electronic (limfogat) prin densitatea și granularitatea lor și au fost interogate pentru marcatorii de interes. Rezultatele sunt exprimate ca procent din totalul celulelor T și determinate folosind debitul minus-1 (controale FMO).

Analiza miR circulantă

ARN-ul total cu conservarea ARN-urilor mici a fost extras din PBMC folosind kitul miRNeasy (QIAGEN) conform instrucțiunilor producătorului. Primerii specifici pentru transcriptază inversă pentru miR-33a, miR-33b și miR-107 (Applied Biosystems) au fost folosiți pentru toate transcrierea inversă miR. PCR-urile cantitative individuale au fost efectuate pe sistemul 7900HT Fast Realtime System (Applied Biosystems, Life Technologies) folosind sonde miR-33a, miR-33b și miR-107 Taqman. SnoU6 a fost utilizat pentru normalizarea studiilor de expresie miR. O modificare relativă a pliurilor în expresia transcrierii genei țintă a fost determinată folosind metoda pragului de ciclu comparativ (2 −ΔΔCT).

Analize statistice

Toate analizele au fost efectuate folosind GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc). Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SD. Grupurile au fost comparate folosind testul t Student sau testul U Mann-Whitney, după caz. Parametrul de corelație a fost determinat utilizând coeficienții de corelație Pearson. Valorile P sunt raportate cu semnificația statistică stabilită în tabelul 1. Glucoza de post a fost similară în ambele grupuri, dar a existat o rezistență crescută la insulină în cohorta obeză. Nivelurile medii de colesterol în post au fost crescute, iar nivelurile de lipoproteine ​​cu densitate ridicată au fost reduse în cohorta obeză comparativ cu omologii lor nonobezi (Tabelul 1).

Caracteristicile subiectelor de studiu

Abrevieri: ns, nesemnificative; HOMA-IR, model de homeostazie de evaluare a rezistenței la insulină; TA, tensiune arterială; z-IMC, scor z pentru IMC. Datele sunt exprimate ca medie ± SD.

Caracteristicile subiectelor de studiu

Abrevieri: ns, nesemnificative; HOMA-IR, model de homeostazie de evaluare a rezistenței la insulină; TA, tensiune arterială; z-IMC, scor z pentru IMC. Datele sunt exprimate ca medie ± SD.

cuantificare sCD163

Niveluri mai ridicate de sCD163 au fost observate în grupul obez (142 vs 107 ng/ml; P = 0,03) (Figura 1A), iar nivelul s-a corelat pozitiv cu creșterea IMC (r = 0,32; P = 0,02), dar nu cu postul insulină (Figura 1, B și C).

Inflamația, celula imună și profilarea miR în obezitatea infantilă. A, Niveluri de sCD163 (ng/ml), o moleculă eliberată de macrofagele proinflamatorii în serul cohortelor nonobeze și obeze. B și C, nivelurile sCD163 se corelează cu IMC, dar nu cu insulina de post. D, Scatterplot care prezintă nivelurile de celule iNKT circulante (exprimate ca procent de limfocite T) determinate prin citometrie în flux; și E, corelația lor cu nivelurile sCD163 în cohorte nonobeze și obeze. F, Scatterplot care arată nivelurile citokinei proinflamatorii TNF-α (pg/ml). G, Scatterplot care prezintă niveluri de leptină (pg/ml) în serul cohortelor nonobeze și obeze. H, Scatterplot care prezintă nivelurile de adiponectină (pg/ml) în serul cohortelor nonobeze și obeze. I, Scatterplot care prezintă nivelurile de IL-1β (pg/mL) produse de PBMC stimulate de LPS din cohorte nonobeze și obeze. Citokinele și adipokinele au fost măsurate în duplicat folosind ELISA. J - L, niveluri de miR-33a (J), miR-33b (K) și miR-107 (L) (expresie relativă comparativ cu controlul endogen) detectate de RT-PCR cantitativă în PBMC-uri circulante din cohorte nonobeze și obeze . *, P Figura 1D). Modificarea celulelor iNKT a fost invers corelată cu nivelurile sCD163 (r = -0,33; P = 0,04) (Figura 1E).

Profilarea citokinelor inflamatorii și a adipokinelor

Au fost detectate niveluri mai ridicate de TNF-α la copiii obezi comparativ cu cei nonobezi (7,2 vs 5,5 pg/ml; P = 0,01) (Figura 1F). O creștere a leptinei serice (1217 față de 460 pg/ml; P Figura 1, G și H). PBMC-urile din ambele cohorte au fost stimulate cu LPS timp de 24 de ore, iar producția crescută de IL-1β a fost demonstrată în cohorta obeză (2108 vs 1518 pg/ml; P = .01) (Figura 1I).

profilarea miR

A existat o creștere de 4 ori a expresiei miR-33a (P = .001) și o creștere de 3 ori a miR-33b în cohorta obeză comparativ cu nonobezele (P = .017) (Figura 1, J și K) . Nu a existat nicio diferență în expresia miR-107 (Figura 1L).

Discuţie

Inflamația și sistemul imunitar înnăscut joacă un rol cheie în patogeneza rezistenței la insulină, T2DM și ateroscleroză la adulți (15). Acest studiu este un studiu observațional al unei cohorte de copii exclusiv caucazieni. Arătăm că modificări ale frecvenței celulelor imune, ale profilului citokinelor și ale regulatorilor genetici metabolici care caracterizează T2DM adult și ateroscleroza sunt prezente la copiii obezi înainte de apariția hiperglicemiei sau a bolilor cardiovasculare evidente.

Obezitatea este asociată cu o stare inflamatorie cronică scăzută, un factor cheie al efectelor metabolice adverse ale creșterii adipozității. Mai multe tipuri de celule imune, inclusiv macrofage, limfocite și neutrofile, au fost descrise pe larg în țesutul adipos al șoarecilor obezi și al oamenilor (16). Numărul crescut de monocite circulante a fost descris la obezitatea infantilă (6). Macrofagele M1 sunt abundente în țesutul adipos inflamat și secretă cantități mari de citokine proinflamatorii, cum ar fi IL-1β și TNF-α (8). Stimulii inflamatorii declanșează scindarea receptorului CD163, producând sCD163, un marker al activării macrofagelor (8).

Acest studiu raportează niveluri ridicate de sCD163 la copiii obezi, reflectând activarea crescută a macrofagelor cu polarizare către subtipul proinflamator M1. Un studiu prospectiv pe aproape 9000 de adulți danezi a constatat că concentrațiile serice crescute de sCD163 sunt asociate cu până la cinci ori riscul de a dezvolta T2DM, chiar și atunci când datele sunt ajustate pentru IMC, activitate fizică și profilul lipidic (17). Deși raportăm o corelație între IMC și sCD163, spre deosebire de studiile la adulți, sCD163 la copii nu se corelează cu rezistența la insulină. Acest lucru poate reflecta o etapă anterioară a spectrului inflamator al obezității. Dacă sCD163 ar putea fi utilizat ca biomarker pentru a acorda prioritate copiilor intervenția asupra stilului de viață pe baza riscului viitor de boală metabolică, va fi necesară o evaluare prospectivă.

Acest studiu demonstrează o frecvență redusă a celulelor iNKT circulante la copiii obezi, cu o relație inversă între concentrația sCD163 și numărul de celule iNKT. Celulele iNKT sunt un subset rar de celule T înnăscute care pun în legătură imunitatea înnăscută și adaptativă și pot acționa ca o legătură între sistemul imunitar și cel metabolic (10). Lucrările recente într-un model murin au demonstrat că șoarecii lipsiți de celule iNKT au crescut în greutate, au rezistent la insulină și au polarizat macrofagele M1 pe o dietă bogată în grăsimi. Transferul adoptiv al celulelor iNKT a dus la scăderea sensibilității la grăsime și insulină, asociată cu o scădere a frecvenței macrofagelor M1 (10). Studiul actual demonstrează aceeași relație inversă între polarizarea crescută a macrofagelor M1 (sCD163) și scăderea frecvenței celulelor iNKT la copiii obezi. Aceasta este o dovadă suplimentară a faptului că neregularitatea imună observată poate contribui la tulburările metabolice asociate cu obezitatea.

Nivelurile crescute de citokine serice proinflamatorii au fost descrise anterior la obezitatea infantilă (6, 7). Schipper și colab. (6) au studiat mediatori inflamatori circulanți noi la copii cu vârsta cuprinsă între 6 și 16 ani. Au raportat niveluri crescute de chemerină, IL-18, EGF și TNF-R2 în grupul obez comparativ cu grupul slab (6). Am extins acest lucru demonstrând o producție modificată de citokine din PBMC. PBMC stimulate de la copii obezi au produs mult mai mult IL-1β decât cei de la omologii lor slabi. IL-1β este eliberat din macrofage ca răspuns la activarea de către complexele mari multiproteice denumite „inflammasomi”. IL-1β joacă un rol cheie în toxicitatea pancreatică a celulelor β, progresia inflamației și inducerea rezistenței la insulină și, prin urmare, este considerată extrem de patogenă în boala metabolică legată de obezitate (18). Antagonismul IL-1β este în prezent vizat ca o posibilă strategie terapeutică pentru T2DM (19). Faptul că PBMC de la copii obezi produc cu 40% mai mult IL-1β decât PBMC de la copiii neobezi este îngrijorător, având în vedere rezistența lor la insulină actuală și riscul probabil crescut de T2DM în viitor.

În amonte de traducerea proteinelor citokinice, ARN-urile mici necodificate reglează expresia genelor și au fost implicate în reglarea fină a multor procese metabolice fiziologice și patologice. Peste 1000 de secvențe au fost descrise la om, mai multe dintre aceste miR identificate în biologia adipocitelor și în metabolismul energetic (11). MiR-33 este un regulator cheie în homeostazia lipidelor și inițierea și progresia aterosclerozei (20). Acest studiu demonstrează o creștere atât a miR-33a, cât și a miR-33b la copiii obezi - miR-uri despre care se știe că inhibă generarea de colesterol lipoproteic cu densitate mare și reduc oxidarea acidului gras celular (20). MiR-107, implicat în rezistența la insulină la adulți, este similar în grupurile obeze și nonobeze. Acest lucru sugerează că unele dintre procesele care stau la baza rezistenței la insulină ar putea să nu fie încă în desfășurare la această vârstă și evidențiază importanța intervenției timpurii chiar și în obezitatea infantilă stabilită. Identificarea miR-urilor nereglementate poate furniza în cele din urmă biomarkeri care susțin intervențiile vizate celor mai expuși riscului de complicații.

O limitare a acestui studiu este că cohortele nu au fost potrivite pentru statutul pubertal sau rezistența la insulină. Vor fi necesare studii suplimentare pentru a determina impactul ambelor asupra diferențelor clare pe care le-am observat între cohorte obeze și neobeze.

Pe scurt, obezitatea copiilor asociată cu rezistența la insulină are impact asupra sistemului imunitar la mai multe niveluri, inclusiv producția de citokine, polarizarea macrofagelor, frecvența înnăscută a celulelor imune și reglarea expresiei genelor. Aceste modificări au fost legate cauzal de apariția bolilor metabolice la vârsta adultă și sugerează traiectoria viitoare a copiilor obezi către dezvoltarea T2DM și a bolilor cardiovasculare premature.

Mulțumiri

Suntem datori copiilor și familiilor care au luat parte la studiul nostru și personalului de asistență medicală endocrină de la Spitalul de Copii al Doamnei, Crumlin, pentru tot ajutorul și sprijinul lor.

E.C. și A.E.H. sunt susținute de Centrul Național de Cercetare pentru Copii. Grupul de Imunologie a Obezității este susținut de Consiliul de Cercetare în Sănătate din Irlanda, Centrul Național de Cercetare pentru Copii, Irlanda și Programul de Bursă UCD Newman. N.F. și L.A.O. sunt sprijinite de un grant european de cercetare. E.C. și A.E.H. sunt susținute de Centrul Național de Cercetare pentru Copii, Irlanda.

Rezumatul dezvăluirii: Autorii declară că nu există conflicte de interese.