1 Institute of Bioscience, Putra University Malaysia, 43400 Serdang, Selangor, Malaysia

efectul

2 Departamentul de Tehnologie a Bioproceselor, Facultatea de Biotehnologie și Științe Biomoleculare, Universitatea Putra din Malaezia, 43400 Serdang, Selangor, Malaezia

3 Aning Biotech Corporation Sdn Bhd., 13G & 13-1, Jalan LJ3, Lembah Jaya Industrial Park, 68000 Ampang, Selangor, Malaysia

4 Școala de Științe Biomedice, Universitatea din Nottingham, Campusul Malaeziei, Jalan Broga, 43500 Semenyih, Selangor, Malaezia

5 Departamentul de biologie celulară și moleculară, Facultatea de biotehnologie și științe biomoleculare, Universiti Putra Malaysia, 43400 Serdang, Selangor, Malaysia

6 Departamentul de biotehnologie a bioproceselor, Institutul de dezvoltare a cercetării agricole din Malaezia, 43400 Serdang, Selangor, Malaezia

7 Centrul de cercetare a biotehnologiei, Institutul de dezvoltare a cercetării agricole din Malaezia, 43400 Serdang, Selangor, Malaezia

Abstract

Orezul de drojdie roșie fermentată a fost consumat în mod tradițional ca medicament în bucătăria asiatică. Acest studiu a avut ca scop determinarea in vivo Efecte hipocolesterolemiante și antioxidante ale extractului de apă din orez de drojdie roșie fermentată produs folosind Institutul de Cercetare și Dezvoltare Agricolă din Malaezia (MARDI) Monascus purpureus tulpini la șoareci hrăniți cu dietă bogată în colesterol. Absența monacolin-k, nivel inferior de γ-acidul aminobutiric (GABA), conținutul mai mare de aminoacizi totali și activitățile antioxidante au fost detectate în extractul de apă din orez de drojdie roșie fermentată MARDI (MFRYR). In vivo Tratamentul MFRYR pe șoareci hipercolesterolemici a înregistrat un efect similar de scădere a lipidelor ca extractul de orez din drojdie roșie comercială (CRYR), deoarece ajută la reducerea nivelului crescut al enzimei hepatice serice și la creșterea nivelului de antioxidanți din ficat. Acest efect a fost, de asemenea, asociat cu reglarea în sus a apolipoproteinelor-E și inhibarea expresiei factorului Von Willebrand. Pe scurt, MFRYR îmbogățit în antioxidanți și aminoacizi fără monacolin-k a prezentat un efect hipocolesterolemic similar cu CRYR, care era bogat în monacolin-k și GABA.

1. Introducere

Orez de drojdie roșie, un produs de Monasc fermentație, a fost folosit în mod tradițional ca medicament (pentru a îmbunătăți digestia și circulația sângelui), conservant (caș de fasole chinezească/brânză, carne, pește etc.) și agent de colorare și inoculant pentru băuturile alcooliceAnchu, somsu) în țările asiatice încă din vremuri străvechi [1]. Poate fi produs fie prin sistemul de fermentare scufundat, fie prin starea solidă. Orezul este mediul de fermentare obișnuit [2] care se produce Monasc produse de fermentație [3] în afară de alte produse agricole, inclusiv dioscoree, manioc, cartof dulce, cartof [4], orz [5], amestec de orez și usturoi [6], soia [7], făină de porumb, făină de arahide, resturi de nucă de cocos, și făină de soia. Monacolin-k (care este identic cu lovastatina) a fost cel mai frecvent standardizat compus monacolinic din orezul de drojdie roșie fermentată pentru proprietatea sa de scădere a lipidelor prin inhibarea 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductază [8]. Alți metaboliți secundari, inclusiv

-Acidul aminobutiric (GABA), acidul dimerumic și monasca, care sunt potențial agenți hipotensivi, antioxidanți și antiinflamatori, au fost, de asemenea, raportate ca fiind prezente în orezul de drojdie roșie fermentată [4, 9, 10].

2. Materiale și metode

2.1. Materiale

Colesterolul, 94%, a fost achiziționat de la Sigma Aldrich (SUA). Extractul comercial din orez de drojdie roșie (CRYR) a fost cumpărat de la magazinul farmaceutic local. Hipoxantină, xantină oxidază, superoxid dismutază, reactiv Folin-Ciocalteu, clorură de aluminiu, azotat de sodiu, acid ascorbic și acid galic au fost obținute de la Sigma Aldrich (SUA). Reactivul Griess provine de la Invitrogen (SUA). Toți solvenții utilizați au fost de reactiv analitic sau de calitate HPLC. Monascus purpureus inoculul de tulpină a fost obținut de la centrul de colectare a culturii MARDI.

2.2. Pregătirea extractului de apă de orez de drojdie roșie fermentată MARDI (MFRYR) folosind Monascus purpureus Tulpini

Orezul spart (1000 g) a fost spălat de 6 ori și înmuiat în apă rece la temperatura camerei timp de 18 ore. Orezul spart înmuiat a fost spălat, autoclavat la 121 ° C timp de 20 de minute și răcit la temperatura camerei. Orezul spart a fost apoi inoculat cu MARDI Monascus purpureus tulpini și incubate aerob la 32 ° C timp de 16 zile. A fost apoi recoltat, uscat la cuptor, măcinat în pulbere și extras cu apă deionizată. MARDI Monascus purpureus tulpini extract de apă de orez de drojdie roșie fermentată (MFRYR) au fost liofilizate folosind un congelator Virtis BenchTop (SP Industries, Inc., SUA) și depozitate într-un răcitor de 4 ° C până la analiză. Orezul nefermentat, MFRYR și extractul comercial de orez de drojdie roșie (CRYR) au fost supuse cuantificării monacolin-k și GABA utilizând metoda UPLC. Analiza Monacolin-k a fost efectuată folosind sistemul Acquity UPLC (Waters Corp., SUA) echipat cu o coloană RP-18 (1.7

m, 2,1 × 100 mm, Waters Acquity, SUA) și fază mobilă cu gradient de 100% acetonitril (eluant A) și 0,1% acid trifluoroacetic (eluant B). Modul de gradient liniar a fost efectuat (debit la 0,2 ml/min) de la 35% la 75% Eluant A timp de 7,8 minute și menținut la 75% Eluant A pentru încă 3,2 minute înainte de a reveni la 35% Eluant A pentru 0,8 minute. Timpul total de analiză a fost stabilit pentru 14 minute cu un volum de injecție de 1 L și temperatura coloanei de 30 ° C. Monacolin-k a fost detectat utilizând un detector de matrice fotodiodă (PDA) la 237 nm cu un interval de detecție între 210 și 350 nm. Pe de altă parte, concentrația de GABA și aminoacizi a fost determinată în conformitate cu Ali și colab. [16]. in vitro efectele antioxidante ale orezului nefermentat, MFRYR și CRYR au fost comparate utilizând testele privind conținutul fenolic total și puterea de reducere a ferului (FRAP) [17].

2.3. Studiu hipocolesterolemiant

Șoareci masculi Balb/c (cu vârsta de 8 săptămâni, greutate corporală medie de

d), obținute de la Departamentul pentru adăpostirea animalelor, Institutul de Biosciență, Universitatea Putra din Malaezia, au fost utilizate pentru experimentele de mai jos. Șoarecii au fost păstrați în cuști de plastic prebeded în condiții controlate de

° C și cicluri standard de 12 ore din zi/lumină întunecată cu alimente și apă ad libitum. Procedurile pentru acest studiu au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Institutului Național de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator (ref.: UPM/FPV/PS/3.2.1.551/AUP-R2). Șoarecii masculi Balb/c au fost repartizați aleatoriu în cinci grupuri cu câte opt animale fiecare, și anume: grupa 1: control normal, șoarecii (p.o.) primind soluție salină normală zilnic; grupa 2: martor negativ, șoareci (p.o.) care primesc colesterol la concentrație de 1000 mg/kg și soluție salină normală numai zilnic; grupa 3: grup tratat cu MFRYR, care a primit colesterol la concentrația de 1000 mg/kg și 6 mg/kg de MFRYR în greutate corporală zilnic; grupa 4: grup tratat cu MFRYR, care a primit colesterol la concentrația de 1000 mg/kg și 60 mg/kg de MFRYR în greutate corporală zilnic; grupul 5: grup tratat cu CRYR, care a primit colesterol la concentrația de 1000 mg/kg și 60 mg/kg de greutate corporală CRYR zilnic.

Toate grupurile (cu excepția grupului 1) au fost preincubate cu colesterol 1000 mg/kg greutate corporală (p.o.) timp de 8 săptămâni și au continuat cu colesterolul și tratamentele cu extract respectiv pentru încă 2 săptămâni. În ultima zi a experimentului, șoarecii au fost sacrificați. Sângele și ficatul au fost colectate pentru următoarele analize.

2.3.1. Analize biochimice ale profilurilor lipidice și hepatice în ser

Profilul lipidic (colesterol total, TAG, LDL și HDL) și profilul hepatic (ALT, ALP și AST) din ser au fost măsurate folosind un analizor biochimic (Hitachi 902 Automatic Analyzer) și reactivi adaptați de la Roche (Germania) [16].

2.3.2. Evaluarea histopatologică a ficatului

Ficatul a fost îndepărtat, fixat și colorat în hematoxilină și eozină (H&E) [16]. Modificările histopatologice ale ficatului din diferite grupuri au fost observate cu ajutorul unui microscop cu câmp luminos (Nikon, Japonia).

2.3.3. În Vivo Analize antioxidante pentru omogenizarea ficatului de la șoareci

Omogenatele hepatice au fost preparate prin îngrășarea ficatului recoltat în PBS rece ca gheața, urmată de omogenizare și centrifugare la 2000 rpm și 4 ° C timp de 5 minute. Supernatanții colectați au fost supuși testelor de superoxid dismutază (SOD) și malondialdehidă (MDA) [16]. O unitate de SOD a fost calculată ca cantitate de proteină necesară pentru a obține o inhibare de 50% și a fost exprimată ca unitate SOD/mg de proteină în timp ce activitatea MDA a fost exprimată ca nmol MDA/g de proteină.

2.3.4. PCR Array on Aherosclerosis Related Gene Expression in Blood

Sângele din grupul 2, grupul 4 și grupul 5 a fost colectat și supus extracției ARN folosind mini kitul RNeasy (Qiagen, SUA). Sinteza ADNc și ateroscleroza șoarecilor RT 2 Profiler PCR array (SABiosciences, SUA) au fost efectuate utilizând un sistem iCycler iQ în timp real PCR (Bio-Rad, SUA) conform protocoalelor producătorului. Rezultatele au fost normalizate cu cele cinci gene de menaj care au fost incluse în kit și modificarea relativă a pliului a fost determinată prin împărțirea datelor normalizate ale genelor din probele din grupele 4 și 5 cu datele normalizate ale genelor din grupul 2 netratat.

2.4. Analize statistice

Toate măsurătorile cantitative au fost transmise ca medie ± S.D. Analizele au fost efectuate folosind analiza unică a varianței (ANOVA), iar mediile grupului au fost comparate prin testul Duncan.

au fost considerate semnificative statistic.

3. Rezultate si discutii

3.1. In vitro Monacolin-k, GABA, aminoacizi, conținut total fenolic și efecte antioxidante (activitate FRAP) ale MFRYR

g/g) dar nu a fost găsit în proba MFRYR. Conținutul GABA a fost înregistrat a fi de 3,4 ori mai mare în eșantionul CRYR comparativ cu eșantionul MFRYR (Tabelul 1). Wang și colab. [19] a demonstrat că modificarea procesului de fermentare ar putea modula producția de monacolin-k și GABA într-o tendință similară utilizând M. purpureus. Astfel, nu a fost surprinzător să constatăm că MFRYR care nu conținea monacolin-k avea o concentrație mai mică de GABA, deoarece acești doi compuși au fost întotdeauna produși cu tendințe similare în timpul fermentației [19]. Pe de altă parte, MFRYR a înregistrat cel mai mare total de aminoacizi liberi și esențiali în comparație cu CRYR. Cu toate acestea, s-a înregistrat că orezul nefermentat și MFRYR au un conținut fenolic de două ori mai mare și activități antioxidante în testul antioxidant FRAP în comparație cu CRYR. Acestea indicau că MARDI’s Monascus purpureus tulpinile au reușit să crească nivelul antioxidant în timpul procesului de fermentare. Rezultatele au arătat că MFRYR conținea niveluri mai ridicate de aminoacizi totali (liberi și esențiali) și antioxidanți în comparație cu extractul de orez din drojdie roșie comercială (CRYR) și orezul nefermentat (Tabelul 1).

3.2. În Vivo Efecte hipocolesterolemiante și antioxidante ale MFRYR

În acest experiment, șoarecii cu nivel ridicat de colesterol au fost induși prin hrănirea colesterolului p.o. la o concentrație de 1000 mg/kg greutate corporală zilnic timp de 8 săptămâni continuu înainte de a continua cu colesterolul și extrageți tratamente pentru încă 2 săptămâni. Rezultatele au arătat reduceri semnificative ale nivelului colesterolului total, al trigliceridelor (TAG) și al lipoproteinelor cu densitate scăzută (LDL) și al creșterii semnificative a lipoproteinei cu densitate ridicată (HLD) în rândul grupurilor de tratament cu extracte comparativ cu grupul de control 2 netratat (Tabelul 2). MFRYR a avut un efect hipocolesterolemic dependent de doză, prin care șoarecii hipercolesterolemici tratați cu concentrație mai mare (60 mg/kg greutate corporală) au arătat o reducere mai semnificativă a profilurilor lipidice serice (Tabelul 2). În plus, MFRYR a avut proprietăți hipocolesterolemice comparabile comparativ cu CRYR, unde tratamentul cu 60 mg/kg greutate corporală de MFRYR și CRYR a arătat aproximativ 22% din colesterolul total, 30% din TAG și 55% din reducerea LDL. În ceea ce privește nivelul HDL, cea mai mare creștere (

36%) a fost înregistrat în grupul de tratament CRYR. Pe lângă profilul lipidic seric, observarea histopatologiei hepatice a fost efectuată în acest experiment. Figura 1 a arătat histologia secțiunilor hepatice pentru grupurile 1, 2, 4 și 5. Picăturile de lipide au fost observate numai la ficatul șoarecilor netratați, ceea ce a indicat faptul că toate tratamentele au fost capabile să reducă acumularea de grăsimi în ficatul dietei cu colesterol ridicat. șoareci. Pe lângă monacolin-k, GABA, care a fost raportat ca fiind unul dintre ingredientele active majore din orezul brun germinat, ar putea contribui și la efectul hipocolesterolemiant [20]. În acest studiu, deși monacolin-k nu a fost detectat și GABA a fost de 3,4 ori mai mic, MFRYR a înregistrat un efect hipocolesterolemic la fel de bun ca CRYR într-o manieră dependentă de doză (Tabelul 2 și Figura 1). Acest efect poate fi contribuit de nivelul crescut al conținutului fenolic și al aminoacizilor totali în MFRYR. Afonso și colab. [21] și Børsheim și colab. [22] a raportat utilizarea potențială a compușilor fenolici și suplimentarea cu aminoacizi pentru a reduce profilul lipidic seric, care la rândul său a completat observațiile noastre în acest studiu. Mai important, compușii fenolici au fost raportați ca fiind unul dintre cei mai importanți compuși bioactivi din dietă care au contribuit la efectul antioxidant [21].