Amy C. Burke

Medicină moleculară * Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Robarts Research Institute, Departamente de Biochimie † Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Brian G. Sutherland

Medicină moleculară * Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Dawn E. Telford

Medicină moleculară * Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Medicină, § Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Marisa R. Morrow

Medicină moleculară * Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Cynthia G. Sawyez

Medicină moleculară * Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Medicină, § Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Jane Y. Edwards

Medicină moleculară * Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Medicină, § Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Maria Drangova

Laboratoare de cercetare imagistică, ** Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Murray W. Huff

Medicină moleculară * Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Institutul de Cercetare Robarts, Departamentele de Biochimie † Universitatea din Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Medicină, § Universitatea Western Ontario, Londra, Ontario, Canada, N6A 5B7

Date asociate

Abstract

În studiul de față, arătăm, la șoareci Ldlr -/- cu obezitate indusă de dietă, dereglare metabolică și ateroscleroză în stadiu intermediar, că intervenția prin adăugarea de naringenină sau nobiletin la o dietă HFHC nu numai că a împiedicat obezitatea continuă și deteriorarea simptomelor sindromului metabolic, dar și masă redusă semnificativ a țesutului adipos, homeostazie normalizată a glucozei și atenuare atât a hiperlipidemiei, cât și a steatozei hepatice. Corectarea parametrilor metabolici a fost însoțită de o reducere a monocitelor sanguine circulante. Colectiv, aceste îmbunătățiri metabolice nu au rezolvat dimensiunea leziunilor aterosclerotice ale sinusului aortic, dar plăcile la șoarecii tratați cu flavonoide au fost caracterizate prin conținut redus de macrofage și colesterol, în concordanță cu regresia leziunii (21, 22).

MATERIALE ȘI METODE

Animale și diete

Colectarea sângelui și a țesuturilor

Cuști metabolice

Tomografie micro-computerizată

Teste de toleranță la glucoză și insulină

Un test de toleranță la glucoză a fost efectuat după 6 ore de repaus prin injecție intraperitoneală cu 15% glucoză în 0,9% NaCI (1 g/kg greutate corporală) (15). Probele de sânge pentru măsurarea glucozei (sistemul de monitorizare a glicemiei conturului Bayer; Bayer Healthcare) au fost prelevate până la 120 de minute după injectare. Un test de toleranță la insulină a fost efectuat după o repaus de 5 ore prin injecție intraperitoneală cu insulină (0,6 UI/kg greutate corporală; Novolin GE Toronto, Novo Nordisk, Cooksville, ON, Canada) (15). Probele de sânge pentru măsurarea glucozei au fost obținute până la 60 de minute după injectare. Toleranța la glucoză și insulină a fost calculată ca o modificare procentuală a glicemiei față de valoarea inițială.

Lipidele tisulare

Lipidele din ficat, cvadriceps, gastrocnemii și solei și aortele de lungime întreagă disecate fără grăsime și țesut conjunctiv au fost extrase folosind metoda Folch din probe stocate la -80 ° C, așa cum s-a descris anterior (14, 25). [Olesterul de colesteril-1,2-3 H (N)] colesteril (PerkinElmer, Guelph, Canada; # NET746L) a fost adăugat pentru a evalua recuperarea. Un standard combinat de 200 μg/ml trioleină și 200 μg/ml colesterol standard a fost preparat în izopropanol și alicotat pentru curbele standard (0-20 μg). Probele și etalonurile au fost uscate sub N2 și s-a adăugat o soluție 1% Triton X-100 în cloroform și s-au lăsat la temperatura camerei timp de 1 oră pentru a se solubiliza. Probele și etaloanele au fost uscate sub N2, urmate de adăugarea de apă deionizată și incubare la 37 ° C timp de 15 min. Probele au fost analizate folosind reactivi enzimatici pentru trigliceride (TG) (Roche Diagnostics, Laval, Canada; TGs/glicerol acoperit, # 11877771 216), colesterol total (TC) (WAKO Diagnostics, Richmond, VA; colesterol E (metoda CHOD-DAOS), # 439-17501) și colesterolul liber (WAKO Diagnostics; metoda colesterolului liber (COD-DAOS), # 435-35801). Esterul colesteril (CE) a fost determinat ca diferența dintre TC și colesterolul liber.

Măsurători plasmatice

Plasma TG și TC au fost măsurate pe un autoanalizator Cobas Mira S (Roche Diagnostics) folosind calibratoare și controale de la Roche Diagnostics (15). S-au utilizat reactivi enzimatici pentru TG (Roche Diagnostics; TGs/glicerol înlăturat, # 11877771 216) și colesterol (Roche Diagnostics; Cholesterol CHOD-PAP, # 11491458-216). Plasma EDTA proaspătă (50 μl) a fost separată prin LC cu proteină rapidă (FPLC) folosind un purificator AKTA și o coloană Superose 6 (14). S-a folosit un debit constant de 0,4 ml/min pentru a colecta fracțiuni de 500 pl. O alicotă din fiecare fracție a fost utilizată pentru măsurarea enzimatică a colesterolului și a TG-urilor atât în ​​probe, cât și în standarde pe o placă de microtitrare cu reactivi enzimatici adăugați [TG: Roche Diagnostics, TGs/glicerol blanked, # 11877771 216 și TC: WAKO Diagnostics, Colesterol E:( Metoda CHOD-DAOS), # 439-17501]. Glicemia a fost măsurată în sângele integral utilizând sistemul de monitorizare a glicemiei conturului Bayer (Bayer Healthcare, Etobicoke, Canada) (15). Insulina plasmatică (ALPCO Diagnostics, Salem, NH; ELISA # 80-INSMSU-E01 cu ultrasunete de șoarece) a fost determinată în probe de plasmă EDTA, depozitate la -80 ° C, printr-un ELISA specific șoarecelui. Evaluarea modelului de homeostazie a rezistenței la insulină (HOMA-IR) a fost calculată folosind următoarea formulă, așa cum a fost descris anterior pentru șoareci: HOMA-IR = 26 × nivelul de insulină în post (ng/ml) × nivelul de glucoză în post (mg/dl)/405 26 ).

Beta oxidarea ficatului

Pentru oxidarea acizilor grași hepatici, ficatul proaspăt (250 mg) a fost omogenizat în tampon fosfat 0,1 M (pH 7,2) conținând 0,25 M zaharoză, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol și 10 μl/ml inhibitor de protează (Sigma-Aldrich; # P8340). Omogenatele au fost centrifugate la 1.000 g la 4 ° C timp de 10 min. Douăzeci de microlitri de supernatant au fost incubați timp de 30 min la 37 ° C cu agitare constantă în tampon fosfat 0,1 M (pH 7,2) conținând 150 mM KCl, 10 mM HEPES, 5 mM Tris malonat, 10 mM MgCl2, 1 mM carnitină, 5 mM ATP și 2 μCi de [9,10-3 H (N)] acid palmitic (PerkinElmer; # NET043001MC) per 50 μM acid palmitic nemarcat complexat cu 0,15% BSA fără acizi grași. Reacțiile au fost oprite cu 200 μl de acid percloric 0,6 N și acizi grași nereacționați extrasați cu hexani. Cei 3 H2O în faza apoasă au fost măsurați prin numărarea scintilației lichide (15, 27).

Expresia genelor

Istologia țesuturilor și imunohistochimia

Analiza morfometrică a zonei leziunii, a zonei miezului necrotic, CD68, a-actinei musculare netede și a colagenului în leziunile de la șoareci din fiecare grup a fost efectuată pe secțiuni seriale. Aria relativă a plăcii aterosclerotice pozitive pentru CD68, α-actina musculară netedă sau colagen a fost determinată ca zona de colorare pozitivă împărțită la aria plăcii respective. Cuantificarea a fost determinată utilizând software-ul ImageJ 1.50 (Institutul Național de Sănătate) pentru CD68, α-actină a mușchiului neted și colagen sau software-ul AxioVision pentru zona leziunii și dimensiunea miezului necrotic. Pentru a determina activarea relativă a caspazei-3, numărul de nuclei celulari imunorați pentru caspaza-3 activată a fost exprimat ca procent din aria leziunii totale. Pentru a se asigura că o regiune standard a fost măsurată la fiecare șoarece, analizele leziunilor au început la originea valvelor aortice. Toate cuantificările au fost efectuate independent de trei persoane.

Citometrie în flux

Analizele celulelor din sânge și măduva osoasă au fost efectuate într-un experiment separat la șoareci Ldlr -/- (n = 8 per grup) utilizând același protocol de inducție și intervenție descris mai sus.

Leucocite din sânge.

Celulele stem hematopoietice.

Citometria de flux a fost efectuată folosind un LSRII (pentru analiză) care rulează software-ul FACS DiVa. Toate datele de citometrie de flux au fost analizate utilizând software-ul FlowJo (Tree Star Inc.)

analize statistice

Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Analizele statistice au fost efectuate folosind Sigma Plot versiunea 14.0. Un ANOVA unidirecțional cu testul Tukey post hoc a fost folosit pentru a testa diferențele dintre grupuri, cu excepția cazului în greutatea corporală și adipozitatea măsurată în timp, în care s-a folosit o măsură repetată bidirecțională ANOVA cu testul post hoc Tukey. Pragurile de semnificație au fost P FIG. 1A ). Ulterior, șoarecii au fost împărțiți în patru grupuri de tratament pentru următoarele 12 săptămâni: un grup a rămas pe dieta HFHC; un al doilea grup a primit intervenție cu șoareci obișnuiți; un al treilea grup a primit intervenție cu dieta HFHC suplimentată cu 3% naringenină; iar al patrulea grup a primit intervenție cu dieta HFHC suplimentată cu 0,3% nobiletin (Fig. 1A).

flavonoide

Depozitele de grăsimi epididimale au fost crescute în timpul inducției cu dieta HFHC (Fig. 1D). În comparație cu valoarea inițială, intervenția cu naringenin sau nobiletin a redus grăsimea epididimală cu 29% și, respectiv, 44%, similar cu pierderea de grăsime la șoarecii intervinți cu chow (Fig. 1D). În schimb, la șoarecii care au rămas doar în dieta HFHC, masa de grăsime epididimală a crescut cu 28%. Aceleași tendințe au fost observate și pentru țesutul adipos inghinal (Fig. S2A suplimentar). Într-un studiu separat, am confirmat reducerile țesutului adipos induse de intervenție cu flavonoidele prin micro-CT (Fig. 1E, Fig. S2B suplimentară). Micro-CT a arătat că volumul de grăsime viscerală a fost redus cu 38-53% și volumul de grăsime subcutanat a fost redus cu 23-43% prin intervenția flavonoidă (Fig. 1E, Fig. S2B suplimentară). Important, volumul țesutului slab nu s-a modificat semnificativ în timpul celor 12 săptămâni de intervenție (Fig. 1F), indicând faptul că pierderea în greutate indusă de intervenție a fost determinată de o reducere a adipozității.

Intervenția flavonoidă a redus inflamația țesutului adipos

Intervenția cu flavonoid crește cheltuielile de energie

Intervenția cu flavonoide citrice crește oxidarea acizilor grași hepatici și reduce steatoza hepatică. Șoarecii Ldlr -/- au fost hrăniți cu o dietă HFHC timp de 12 săptămâni. Ulterior, aceiași șoareci au fost tratați cu flavonoide adăugate la dieta HFHC timp de încă 12 săptămâni. A: TG hepatice (n = 7-8 pe grup). B: CE hepatică (n = 7-8 pe grup). C: colesterol liber hepatic (n = 7-8 pe grup). D: Oxidarea ex vivo a acizilor grași hepatici (n = 7-10 per grup). E: Expresia genei hepatice (n = 12 per grup). F: Greutatea ficatului (n = 22 pe grup). Datele reprezintă media ± SEM. Diferite litere sunt statistice diferite de ANOVA cu testul Tukey post hoc (șoarecii P -/- au dezvoltat hipercolesterolemie și hipertrigliceridemie ( FIG. 5A–D). Intervenția cu suplimentarea cu naringenin sau nobiletin la dieta HFHC timp de 12 săptămâni a redus colesterolul plasmatic (> 50%) și TG (> 50%) (Fig. 5A, B). Scăderea lipidelor plasmatice mediată de flavonoizi a fost limitată la colesterolul VLDL și LDL, fără modificări ale nivelului colesterolului HDL (Fig. 5C - H). Reduceri mai mari ale colesterolului VLDL și LDL au fost observate cu intervenția chow (Fig. 5F, G).

Intervenția cu flavonoide citrice nu atenuează dimensiunea leziunii, dar încetinește acumularea de colesterol aortic. Șoarecii Ldlr -/- au fost hrăniți cu o dietă HFHC timp de 12 săptămâni. Ulterior, aceiași șoareci au fost tratați cu flavonoide adăugate la dieta HFHC timp de încă 12 săptămâni. Aortele au fost disecate, iar sinusul aortic secționat și analizat histologic. A: Secțiuni reprezentative ale sinusului aortic colorate cu roșu uleios-O și hematoxilină și cuantificarea zonei leziunii (n = 12-21 per grup). Bara de scară este de 500 μm. B: colesterol total (TC), ester colesteril CE și colesterol liber (FC) în aorta întreagă (n = 6-8 pe grup). C: Expresia genică în aortae întregi (n = 6-8 pe grup). Datele reprezintă media ± SEM. Diferite litere sunt statistice diferite de ANOVA cu testul Tukey post hoc (P Fig. 6A, B). După 12 săptămâni de inducție, plăcile au fost compuse în principal din macrofage (~ 66%) ( FIG. 7A, H). Conținutul de macrofage în leziune a fost redus cu intervenția naringeninei (-47%), nobiletin (-50%) și chow (-69%) (Fig. 7A, H), în concordanță cu conceptul că epuizarea macrofagelor este caracteristică unei regresii placă (21). Deși procentul zonei de leziune ocupate de macrofage a fost, de asemenea, mai mic la șoarecii care continuau cu HFHC (-23%), scăderea a fost mai mare cu intervenția flavonoidă sau cu chow (Fig. 7A, H). Comparativ cu leziunile inițiale, continuarea dietei HFHC a crescut aria nucleului necrotic (de la 6% la 14%), a crescut procentul de celule apoptotice (de la 0,2% la 1,0%), a redus celulele musculare netede ale leziunii (SMC) (de la 3,5 % la 1,8%), și creșterea colagenului leziunii (de la 20% la 35%) (Fig. 7B - F, Fig. S5 suplimentar). Intervenția cu naringenin, nobiletin sau chow a oprit creșterea dimensiunii miezului necrotic, a inhibat creșterea apoptozei, a atenuat scăderea SMC și a menținut creșterea colagenului leziunii (Fig. 7B - F, suplimentar Fig. S5). În mod colectiv, aceste modificări induse de intervenție în compoziția leziunii sunt caracteristice leziunilor mai stabile (Fig. 7G).

În studiul de față, am testat un protocol de inducție și timp de intervenție, 12 săptămâni de inducție cu o dietă HFHC, urmată de 12 săptămâni de intervenție, fie cu flavonoid citric suplimentat la dieta HFHC. Aceste linii cronologice au fost alese pe baza modelelor de regresie a aterosclerozei din literatură și sunt similare cu alte linii cronologice de intervenție flavonoidă (21, 36, 37). Douăsprezece săptămâni de inducție HFHC au fost suficient timp pentru a induce obezitate moderată, hiperlipidemie semnificativă, rezistență moderată la insulină, steatoză hepatică și ateroscleroză intermediară. Douăsprezece săptămâni de intervenție au fost suficiente pentru a îmbunătăți complet obezitatea și rezistența la insulină, dar hiperlipidemia moderată și steatoza hepatică au persistat, rezultând îmbunătățiri ale morfologiei leziunilor, dar fără o regresie a dimensiunii plăcii. Acest lucru ridică posibilitatea interesantă ca o durată mai lungă a intervenției cu flavonoizi să conducă la o rezolvare mai mare a acestor tulburări. Ar fi de interes să se testeze diferite durate de intervenție și perioade de inducție potențial mai lungi pentru a testa limitele intervenției flavonoide asupra rezolvării obezității induse de dietă, sindromului metabolic și aterosclerozei.

O serie de studii la om folosind flavonoide citrice purificate au demonstrat îmbunătățiri ale lipidelor plasmatice, metabolismului glucozei și obezității [revizuite în (11)]. Cu toate acestea, rezultatele au fost modeste și s-au observat inconsistențe între studii și variații considerabile între pacienți. Biodisponibilitatea flavonoidelor este scăzută, în special la om; metabolismul flavonoidelor diferă între subiecți și diferențele în microflora enterică pot fi responsabile pentru variabilitatea considerabilă interindividuală în absorbție și parametrii farmacocinetici (11). Sunt necesare studii umane controlate mai mari pentru a evalua doza, biodisponibilitatea, eficacitatea și siguranța pentru dezvoltarea terapeutică.

În rezumat, am arătat că intervenția prin adăugarea de flavonoide citrice, naringenin sau nobiletin, la o dietă bogată în grăsimi la șoarecii obezi inversează creșterea în greutate și adipozitatea similară cu intervenția cu chow, fără a reduce aportul de alimente. Șoarecii tratați cu naringenin sau nobiletin consumă mai multe calorii, dar consumă mai multă energie fără o activitate ambulatorie crescută. Șoarecii tratați cu flavonoizi recâștigă sensibilitatea la insulină și inversează hiperinsulinemia complet. Lipidele plasmatice sunt scăzute și oxidarea hepatică a acizilor grași este crescută, ducând la reducerea lipidelor hepatice. În mod colectiv, aceste îmbunătățiri ale factorilor de risc aterogeni nu au dus la contracția leziunii, dar au îmbunătățit morfologia leziunii, în special reducând conținutul de macrofage ale leziunilor, în concordanță cu stadiile incipiente ale regresiei aterosclerozei. Aceste studii evidențiază utilitatea terapeutică potențială a naringeninei sau a nobiletinului, în special în contextul obezității existente și al disfuncției metabolice.