Arif Yurdagul, Jr.

1 Departamentul de patologie și patobiologie translațională, LSU Health Sciences Center, Shreveport, LA 71130, SUA

2 Departamentul de biologie și anatomie celulară, Centrul de științe ale sănătății LSU, Shreveport, LA 71130, SUA

Florian J. Sulzmaier

3 UCSD San ​​Diego, Moores Cancer Center, Departamentul de Medicină a Reproducerii, 0803 3855 Dr. Științe ale Sănătății, La Jolla, CA 92093, SUA

Xiao L. Chen

3 UCSD San ​​Diego, Moores Cancer Center, Departamentul de Medicină a Reproducerii, 0803 3855 Dr. Științe ale Sănătății, La Jolla, CA 92093, SUA

4 Laborator cheie de stat de biologie a stresului celular, Centrul de inovare pentru rețeaua de semnalizare celulară, Școala de Științe ale Vieții, Universitatea Xiamen, Xiamen, Fujian 361102, China

Christopher B. Pattillo

5 Departamentul de fiziologie celulară și moleculară, LSU Health Sciences Center, Shreveport, LA 71130, SUA

David D. Schlaepfer

3 UCSD San ​​Diego, Moores Cancer Center, Departamentul de Medicină a Reproducerii, 0803 3855 Dr. Științe ale Sănătății, La Jolla, CA 92093, SUA

A. Wayne Orr

1 Departamentul de patologie și patobiologie translațională, LSU Health Sciences Center, Shreveport, LA 71130, SUA

2 Departamentul de biologie și anatomie celulară, Centrul de științe ale sănătății LSU, Shreveport, LA 71130, SUA

ABSTRACT

INTRODUCERE

În timpul aterosclerozei timpurii, lipoproteinele cu densitate mică (LDL) se acumulează în arterele de dimensiuni medii și mari ale vasculaturii ca particule LDL native. Cu toate acestea, creșterea nivelului de stres oxidativ favorizează oxidarea LDL (Goyal și colab., 2012). Legarea LDL oxidat (OxLDL) la receptorii scavenger determină activarea celulelor endoteliale, un fenotip caracterizat prin permeabilitate sporită și expresie genică proinflamatorie (Xu și colab., 2013). Această modificare a fenotipului celulelor endoteliale necesită activarea factorilor de transcripție, cum ar fi factorul nuclear-κB (NF-κB), care evocă expresia moleculei de aderență proinflamatoare, cum ar fi E-selectina, molecula de adeziune a celulelor vasculare-1 (VCAM-1) și molecula de adeziune intercelulară-1 (ICAM-1). Această modificare a funcției celulelor endoteliale prin semnalizarea NF-resultsB are ca rezultat recrutarea celulară inflamatorie îmbunătățită și inițiază dezvoltarea aterosclerozei (Libby și colab., 2011).

Activarea NF-κB în celulele endoteliale joacă un rol central în modularea expresiei genelor prin factori aterogeni multipli (Sun și Andersson, 2002). În celulele în repaus, inhibitorul proteinelor NF-κB (IκB) sechestrează NF-κB în citosol. La stimularea cu mediatori inflamatori, IκB kinaza β (IKKβ, cunoscută și sub numele de IKBKB) fosforilează IκB, rezultând ubicuitate și degradare proteozomală, permițând astfel translocația și transcripția nucleară NF-κB (Lawrence, 2009). IKKβ fosforilează, de asemenea, subunitatea p65 a NF-κB (RelA, în continuare doar NF-κB) pe S536, care este crucială pentru expresia genetică maximă dependentă de NF-κB (Lawrence, 2009). Alternativ, NF-κB poate fi indus de căi independente de IKK, cum ar fi fosforilarea tirozinei indusă de stresul oxidativ al proteinelor IκB rezultând eliberarea NF-κB și translocația nucleară fără degradarea IκB (Sun, 2011; Takada și colab., 2003) . Cu toate acestea, nivelurile fiziologice ale stresului oxidativ pot activa și semnalizarea clasică NF-κB dependentă de IKK (Gloire și colab., 2006). Deși oxLDL determină producerea de specii reactive de oxigen (ROS) în celulele endoteliale, mutanții IκBα deficienți în serină-fosforilare diminuează expresia VCAM-1 indusă de oxLDL, sugerând că este implicat un mecanism dependent de IKK (Robbesyn și colab., 2004; al., 2014; Yurdagul și colab., 2014). Cu toate acestea, rolul IKKβ sau al kinazelor sale din amonte în activarea NF-κB indusă de oxLDL rămâne necunoscut.

REZULTATE

determina

MATERIALE ȘI METODE

Cultură de celule endoteliale, transfecții și separare de citosoli și nucleare

Imunoblotare, imunocitochimie și test de ligare de proximitate

Imunoprecipitații și analiza kinazei IKK

Test de adeziune monocitară

Monocitele THP-1 umane au fost etichetate cu Cell Tracker Green (Life Technologies) conform protocolului producătorului. Monostraturile HAEC au fost tratate așa cum s-a descris și s-au adăugat 106 monocite pe godeu dintr-o placă cu 24 de godeuri (raport de 5: 1 monocite la celule endoteliale). Monocitelor li s-a permis să se atașeze timp de 10 minute la 37 ° C în HBSS conținând Ca2+ și Mg2+. Supernatantul și două spălări au fost colectate ca fracție neacordată și monocitele atât aderente cât și neaderente au fost apoi lizate în NaOH 100 mM. Fluorescența la 488 nm a fost cuantificată utilizând un cititor de plăci de fluorescență FLUOstar Optima, iar rezultatele au fost normalizate la fracțiune nelegată și exprimate ca procent de monocite care aderă.

Specii reactive de oxigen

HAEC-urile au fost cultivate în medii fără fenol roșu, apoi încărcate cu 10 μM DCFDA timp de 45 de minute și tratate cu oxLDL de diferite ori. Celulele au fost apoi citite pe un cititor de plăci FLUOstar și unitățile arbitrare au fost cuantificate ca modificări ale pliurilor.

Matrice de citokine

Plasma de șoarece a fost testată utilizând un panou de matrice de citokine de șoarece conform protocolului producătorului (sisteme de cercetare și dezvoltare, MN). S-au imaginat matrici de citokine și s-au calculat valorile densitometriei utilizând software-ul Image Lab (Biorad, CA). Valorile citokinelor au fost apoi comparate între grupurile martor și kinază moartă utilizând testul t Student cu un interval de încredere de 95% pentru a identifica semnificația.

analize statistice

Comparațiile statistice între grupuri au fost efectuate utilizând software-ul GraphPad Prism. Datele au fost testate pentru normalitate (testul Kolmogorov - Smirnov) și datele care au trecut ipoteza normalității au fost analizate utilizând un test t Student, ANOVA unidirecțional cu Newman - Keuls post-test sau ANOVA bidirecțional cu Bonferroni post-teste. Datele care nu au reușit să presupună normalitatea au fost analizate folosind testul non-parametric Mann-Whitney U și testul Kruskal-Wallis cu analiză post-hoc. Barele de eroare indică s.e.m.

Mulțumiri

Autorii ar dori să-i mulțumească lui David Krzywanski (LSUHSC-Shreveport, Shreveport, LA) pentru furnizarea de monocite THP-1 și Jun-Ichi Abe (Universitatea din Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX) pentru furnizarea de tip sălbatic și dominant -construite RSK negative.

Note de subsol

Interese concurente

Autorii nu declară interese concurente sau financiare.