Yuling Li

1 Departamentul de Fiziopatologie, Universitatea de Medicină Binzhou, Yantai 264003, Shandong, China

mir-182-5p

Shudong Chen

2 Departamentul de Chirurgie Gastro-intestinală Secția II, Spitalul Yantai Yuhuangding afiliat al Universității Qingdao, Yantai 264000, Shandong, China

Zhengfei Shan

3 Departamentul de Urologie, Spitalul Yantai Yuhuangding afiliat al Universității Qingdao, Yantai 264000, Shandong, China

Liyan Bi

4 Departamentul de Otologie Transformativă și Centrul de Neuroștiințe, Universitatea de Medicină Binzhou, Yantai 264003, Shandong, China

Shengqiang Yu

3 Departamentul de Urologie, Spitalul Yantai Yuhuangding afiliat al Universității Qingdao, Yantai 264000, Shandong, China

Yongwei Li

3 Departamentul de Urologie, Spitalul Yantai Yuhuangding afiliat al Universității Qingdao, Yantai 264000, Shandong, China

Sen Xu

5 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Universitatea de Medicină Binzhou, Yantai 264003, Shandong, China

Abstract

Introducere

Cancerul gastric (GC) este una dintre cele mai frecvente tumori maligne ale sistemului digestiv, are aproximativ 951.600 de cazuri noi și provoacă 723.100 de decese în fiecare an [1]. Deși a existat o scădere constantă a incidenței și mortalității GC în țările dezvoltate, în zonele mai puțin dezvoltate, aceasta are încă un al treilea nivel amenințător atât în ​​incidența cancerului, cât și în mortalitate [1]. Cauzele GC sunt complexe și pot include factori precum o dietă dezechilibrată, fumatul, alcoolul și infecția cu Helicobacter pylori [2]. Mai mult, patogenia GC este, de asemenea, raportată la factori genetici precum metilarea ADN-ului, inactivarea epigenetică a mai multor gene, amplificări și deleții genetice și mutații somatice aberante [2].

Absența simptomelor clinice specifice pune obstacole în diagnosticul precoce al GC [3]. Prin urmare, pacienții cu GC sunt întotdeauna diagnosticați în stadii avansate care duc la metastaze grave și prognostic slab. Rata de supraviețuire la 5 ani este mai mică de 30% [4-6]. Chirurgia a fost opțiunea principală de tratament pentru GC în ultimele decenii, cu un tratament auxiliar de chimioradiere și chimioterapie [7,8]. Terapia medicamentoasă pe bază de gene este o abordare potențială pentru tratamentul GC [9]. Cu toate acestea, din cauza lipsei de înțelegere a mecanismelor moleculare din spatele dezvoltării GC, în prezent nu există o terapie eficientă pentru GC [10].

Datele din baza de date TargetScan sugerează că există o relație de direcționare între miR-182-5p și RAB27A. Am făcut presupunerea că miR-182-5p reglează activitatea în celulele GC vizând RAB27A și am efectuat o serie de experimente pentru a testa această ipoteză. Am investigat rolul miR-182-5p și am evaluat mecanismul său de reglare în tumorigeneză gastrică și progresii.

Materiale și metode

Țesuturile umane

Treizeci de GC umane și țesuturile para-carcinomului (distanța de carcinomul gastric a fost de 2 cm) au fost obținute de la Spitalul Afiliat Yantai Yuhuangding din Universitatea Qingdao în perioada 20 martie 2015 - 20 mai 2016. Probele au fost ulterior congelate în azot lichid pentru continuarea studiilor. Țesuturile para-carcinomului au fost identificate de trei medici din spital și s-au confirmat că sunt libere de cancer. Toți pacienții și-au dat consimțământul în cunoștință de cauză și aprobarea etică a fost obținută de la Comitetul de Etică Umană al Spitalului Afiliat Yantai Yuhuangding al Universității Qingdao.

Cultură de celule

Liniile celulare de cancer gastric uman (HGC) și liniile celulare gastrice normale umane care cuprind HGC-27, MKN-45, SGC-7901 și MGC-803 au fost cumpărate de la banca de celule a Academiei de Științe din China (Shanghai, China) și cultivate la Roswell Park Memorial Institute (RPMI, New York, SUA) -1640 cu 10% ser fetal bovin (FBS) într-o atmosferă umidificată de 37 ° C și 5% CO2.

Extracția ARN și PCR cantitativă în timp real

ARN-ul total al țesuturilor și celulelor a fost extras folosind reactivul TRIzol conform instrucțiunilor producătorului. ARN-urile totale (5 μg) și miARN-urile (5 μg) au fost apoi transcrise invers în ADN-uri complementare (ADNc). Amestecul SYBR Green PCR a fost utilizat pentru analiza cantitativă în analiza cantitativă în timp real PCR (qRT-PCR). Primerii pentru miR-182-5p, RAB27A și alte gene au fost achiziționați de la RiboBio Co., Guangzhou, China (Tabelul 1). Vectorii PCMV-Sport6 ​​(Invitrogen, Carlsbad, CA, S.U.A.) au fost folosiți pentru recombinarea ADNc-urilor RAB27A, iar tehnica de secvențiere a ADN-ului (contractată cu Sangon Biotech, Shanghai, China) a fost utilizată pentru a confirma recombinarea cu succes. U6 (RNU6B) și GAPDH au fost utilizate ca standarde interne de normalizare pentru mRNA miR-182-5p și respectiv RAB27A. Statisticile au fost analizate folosind metoda 2 - Δ Δ C t.

tabelul 1

Secvența primerilor pentru amplificarea miARN, RAB27A și a genelor de control intern

Grund înainte Grund invers
miR-182-5p5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3 ′5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3 ′
U65′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ′5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ′
RAB27A5′-GTAAGTGACATAGTAGTT-3 ′5′-TTATTCGTAGGTCTAATG-3 ′
GADPH5′-CCACCCAGAAGACTGTGGAT-3 ′5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3 ′

Transfecția și gruparea celulară

Pentru a investiga rolul miR-182-5p asupra activităților celulelor GC, celulele HGC-27 în faza de creștere logaritmică au fost transfectate cu 50 nM mimice miR-182-5p sau 8 ng mimics control (GenePharma, Shanghai, China) folosind 1 μl a reactivului Lipofectamine 2000. Grupurile au fost concepute după cum urmează: grupul de control, grupul miR-mimics, grupul anti-miR, grupul de control anti-negativ (NC) și grupul miR-NC. Pentru a studia rolul RAB27A asupra activităților celulelor GC, celulele HGC-27 au fost transfectate cu vectori lentivirali recombinați cu secvența genei RAB27A umane (vectorul construit a fost plenti-GIII-Ubc-RAB27A). Acestea au fost alocate grupului abundent-RAB27A și celulele transfectate cu plasmida vector goală au fost desemnate ca grup NC (denumit grup plenti-nul).

Test de bromură de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazoliu (MTT)

Viabilitatea celulelor HGC-27 a fost măsurată utilizând testul bromurii de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium (MTT). Celulele au fost centrifugate și resuspendate în mediu complet proaspăt. Ulterior, celulele au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri cu 1 × 104 celule pe godeu. După celulele atașate la perete, viabilitatea celulei a fost măsurată la fiecare 24 de ore. Soluția MTT (20 μl) și DMSO (150 μl) au fost adăugate la cultura celulară și rata de absorbție a celulelor la 490 nm a fost măsurată folosind un cititor de microplacă [29].

Citometrie de flux (FCM)

Ciclul celular și apoptoza celulară au fost evaluate utilizând metoda de citometrie în flux (FCM). Patruzeci și opt de ore după transfecție, celulele HGC-27 au fost spălate cu PBS și amestecate într-un congelator de -20 ° C cu 70% alcool la o concentrație de 106 celule/ml [29]. Ulterior, celulele au fost lăsate la 4 ° C peste noapte. A doua zi, probele au fost centrifugate, spălate cu PBS și apoi supernatantul a fost aruncat. Celulele au fost apoi resuspendate într-o băutură conținând PI (50 mg/l) și RNază (50 mg/l) și incubate timp de aproximativ 25 min. În plus, alte celule transfectate au fost amestecate cu lichiorul Annexin V-FITC/PI conform instrucțiunilor producătorului. După ce celulele au fost incubate timp de 20 de minute, FCM a fost utilizat pentru a evalua apoptoza celulară.

Testul Transwell

Capacitatea de invazie a celulelor a fost evaluată folosind testul Transwell. Partea superioară a membranelor a fost acoperită cu Matrigel. RPMI 1640 (500 pl) conținând 10% FBS a fost adăugat la camerele inferioare. Mediul fără ser și celulele HGC-27 (3 × 105) au fost plasate în camerele superioare. După cultivare timp de 48 de ore, 4% metanol și Crystal Violet au fost folosite pentru fixarea și colorarea celulelor care au invadat membrana respectiv. Ulterior, a fost utilizat un microscop (100 ×) pentru a număra celulele din zece câmpuri aleatorii pentru a estima invazivitatea relativă a celulelor din diferite grupuri. Absorbția optică a celulei a fost măsurată sub o lungime de undă de 570 nm în fiecare grup.

Test de vindecare a rănilor

Testul de vindecare a rănilor a fost efectuat pentru a examina capacitatea migratorie a celulelor HGC-27. Suspensia celulară a fost însămânțată într-o placă cu șase godeuri cu 2 ml de suspensie în fiecare godeu. După ce confluența a atins 80%, s-a folosit o pipetă sterilă pentru a zgâria suprafața celulei. Celulele au fost apoi cultivate într-un incubator la 37 ° C și 5% CO2. Suprafața celulei a fost fotografiată folosind un microscop inversat și închiderea plăgii a fost măsurată la 0 și 24 de ore după zgâriere.

Testul genei raportor dual-luciferază

RAB27A 3'-UTR mutant a fost construit folosind tehnologia mutației site-ului. Secvențele RAB27A 3'-UTR de tip sălbatic și secvențele mutate RAB27A 3'-UTR au fost amplificate folosind PCR. Secvențele amplificate au fost recombinate cu plasmide care conțineau gena luciferază licurică. Un total de 3 × 105 celule au fost însămânțate într-o placă cu 12 godeuri și lăsate peste noapte. Când celulele au atins confluența de aproximativ 80%, vectorii recombinați [30] și controlul intern Rellina Luciferase pRL-CMV au fost co-transfectate fie cu miR-mimici, fie cu miR-NC în celulele HGC-27 folosind Lipofectamina 2000. Activitatea relativă de luciferază a fost detectată la 48 de ore după transfecție utilizând sistemul de testare a genei reporter dual-luciferază conform instrucțiunilor producătorului.

Western blot

Un total de 5 × 105 celule au fost însămânțate într-o placă cu 6 godeuri, cultivate peste noapte, iar apoi [30] proteina totală a țesuturilor și celulelor a fost extrasă folosind tampon RIPA. Ulterior, electroforeza pe gel de dodecil sulfat-poliacrilamidă de sodiu (SDS/PAGE; 12,5% gel) a fost efectuată pentru a izola proteinele din lizat. Proteinele au fost apoi transferate pe o membrană de difluorură de poliviniliden (PVDF) și s-a folosit lapte degresat 5% pentru a bloca membrana la temperatura camerei timp de 1 oră. Membranele au fost incubate cu anticorpi primari peste noapte la 4 ° C. A doua zi, membranele au fost spălate cu soluție salină tris-tamponată cu Tween (TBST) și incubate cu anticorpi secundari cuplați cu peroxidază de hrean. Semnalele au fost observate folosind chemiluminescența și sistemul de detectare Western blot. Software-ul ImageJ a fost utilizat pentru a analiza densitatea proteinelor.