Abstract

Introducere

Obezitatea este factorul principal al creșterii prevalenței rezistenței la insulină/diabetului de tip 2 (T2D) și a complicațiilor asociate, inclusiv bolile cardiovasculare, boala ficatului gras nealcoolic (NAFLD) și forma sa severă, steatohepatita nealcoolică (NASH). Obezitatea hipertrofică cu celule adipoase extinse este strâns asociată cu rezistența la insulină și un țesut adipos subcutanat inflamat și neregulat cu capacitate redusă de stocare a excesului de grăsime și, în schimb, promovând acumularea de lipide ectopice în alte țesuturi, inclusiv ficatul și mușchiul scheletic (1). O abordare terapeutică atractivă pentru tratarea obezității hipertrofice este promovarea rumenirii țesutului adipos alb pentru a crește biogeneza mitocondrială și cheltuielile de energie ale întregului corp. Cu toate acestea, este de asemenea nevoie de noi medicamente sensibilizante la insulină pentru a trata rezistența la insulină/T2D, independent de efectele asupra obezității.

noul

Noi și alții am demonstrat anterior că creșterea țesutului adipos și nivelurile circulante de BMP4 pot contracara obezitatea prin promovarea rumenirii țesutului adipos alb (1,2). Cu toate acestea, atât țesutul adipos, cât și nivelurile serice ale BMP4 sunt de fapt crescute la obezitate la om și la șoareci (3-5), în timp ce markerii celulelor adipoase bej/maro sunt reduse la obezitate.

Un motiv important pentru acest lucru este că antagoniștii endogeni ai BMP sunt, de asemenea, crescuți. Țesutul adipos uman exprimă mai mulți antagoniști, inclusiv Gremlin 1, Noggin, Chordin-like 1, Follistatin și BAMBI (3), dar am găsit antagonistul secretat BMP2/4 Gremlin 1 ca fiind antagonistul endogen principal care inhibă diferențierea celulelor precursoare induse de BMP4 conversie adipocite bej/maro (3). Mai mult, Gremlin 1 este o proteină secretată, crescută semnificativ în țesutul adipos la obezitatea hipertrofică umană, în timp ce este de fapt redusă la șoarecii obezi la care Noggin este crescut în primul rând (3).

Nivelurile crescute ale acestor antagoniști în țesutul adipos obez reduc semnalizarea BMP4, angajamentul celular precursor și inducerea ulterioară a adipogenezei bej/maro (1,3). În concordanță cu aceasta, am demonstrat, de asemenea, că semnalizarea BMP4 este redusă semnificativ în țesutul adipos în obezitate, în ciuda expresiei și secreției crescute de BMP4 (1,3). Luate împreună, aceste observații sugerează că Gremlin 1 este o țintă interesantă în obezitatea umană și că poate fi implicat și în dezvoltarea obezității hipertrofice și a fenotipului obez al complicațiilor de rezistență la insulină (adică T2D și NAFLD/NASH), ca marker de acumulare crescută de grăsime ectopică. NAFLD este caracterizată prin acumulare de triacilgliceroli intrahepatici (TG) și este prezentă la 75-90% dintre subiecții cu T2D (6,7). NAFLD poate evolua către starea severă a NASH, caracterizată prin remodelare histologică avansată, inclusiv fibroză, inflamație lobulară, balonare hepatocelulară și risc de cancer la ficat.

În acest studiu, am măsurat nivelurile serice ale Gremlin 1 și mușchiul scheletic, țesutul adipos și ARNm hepatic în cohorte fără și cu diabet și la subiecții cu NAFLD/NASH. De asemenea, am evaluat efectul Gremlin 1 asupra semnalizării și acțiunii insulinei în aceste trei țesuturi țintă majore pentru insulină. Rezultatele noastre identifică Gremlin 1 ca un biomarker nou și țintă terapeutică potențială în rezistența la insulină și complicațiile asociate.

Proiectare și metode de cercetare

Studiați populațiile

Toate studiile au fost efectuate în conformitate cu Declarația de la Helsinki. Toți subiecții au dat consimțământul scris în scris înainte de a lua parte la studii.

Cohorta FDR/Control

În această cohortă, au fost studiați 34 de subiecți non-obezi: 17 indivizi cu cel puțin o rudă cunoscută de gradul I (FDR) cu T2D și 17 indivizi fără predispoziție genetică cunoscută pentru T2D, definiți ca fără antecedente familiale (subiecți martor). Grupurile au fost potrivite pentru sex (10 femei în ambele grupuri) și IMC și au avut o vârstă similară (Tabelul 1). Nivelurile de insulină plasmatică și de glucoză în jeun au fost utilizate pentru a calcula rezistența la insulină definită ca un indice HOMA de rezistență la insulină (HOMA-IR) utilizând formula: HOMA-IR = (glucoză plasmatică la jeun × insulină plasmatică la jeun) /22,5. Biopsiile locale de țesut adipos subcutanat au fost obținute din peretele inferior al abdomenului, după cum sa raportat anterior (3). Protocolul de studiu a fost aprobat (S655-03) de către Comitetul Etic al Academiei Sahlgrenska, Universitatea din Göteborg.

Alte cohorte

Eșantioane pereche de țesut adipos visceral subcutanat, omental și ficat au fost colectate în timpul intervenției chirurgicale laparoscopice abdominale, așa cum s-a descris anterior (6). Țesutul adipos a fost imediat înghețat în azot lichid și depozitat la -80 ° C. Studiul a fost aprobat de Comitetul de Etică al Universității din Leipzig (numărul de aprobare 159–12–21052012; Leipzig, Germania). IMC a fost calculat în funcție de greutate (kilograme) împărțit la pătratul înălțimii (metri).

Cohorta ND/D (Tabelul 1): într-un studiu transversal, am investigat GREMLIN 1 mARN în probe de țesut adipos subcutanat visceral/omental și abdominal pereche (n = 233; IMC> 30 kg/m 2). Dintre aceștia, 105 indivizi au avut niveluri normale de glucoză, iar 128 au avut T2D.

Cohorta GIR (Tabelul 1): la 93 de indivizi (IMC 24-37 kg/m 2) cu toleranță normală la glucoză (NGT), țesutul adipos GREMLIN 1 mARN a fost evaluat în raport cu viteza de perfuzie a glucozei (GIR) în cleme euglicemice-hiperinsulinemice conform procedurilor descrise anterior (6).

Cohorta ND/D/NAFLD (Tabelul 1): o cohortă de 52 de indivizi obezi cu o gamă largă de conținut de grăsimi hepatice și cu (n = 28; IMC 34 ± 5,8 kg/m 2) sau fără T2D (n = 23; IMC 34 ± 5,9 kg/m 2) au fost studiate. GREMLIN 1 mARN a fost măsurat atât în ​​probe de țesut adipos asociat, cât și în probe de ficat. Pentru măsurarea parametrilor metabolici, toate probele de sânge inițiale au fost colectate între 8 și 10 a.m. după un post peste noapte și analizat așa cum s-a descris anterior (6).

Cohorta Nob/obND/obD (Tabelul 1): nivelurile serice de Gremlin 1 au fost analizate la 45 de indivizi cu NGT (n = 30) cu un IMC 2 (n = 15) sau> 30 kg/m 2 (n = 15) sau cu T2D cunoscut (n = 15).

Intervenția chirurgicală bariatrică în doi pași a fost o cohortă de 55 de persoane cu obezitate morbidă care au suferit o abordare chirurgicală bariatrică în doi pași cu o gastrectomie de mânecă ca prim pas și, după 12 ± 2 luni, o operație de by-pass gastric Roux-en-Y ca al doilea pas, după cum sa raportat anterior (8).

Aceste cohorte diferite au fost, de asemenea, în esență neutre din punct de vedere sexual, cu aproximativ 70% femei și 30% bărbați și sunt rezumate ca o diagramă de flux în Fig. 1.

Diagnosticul diabetului

Diagnosticul T2D comparativ cu toleranța normală sau afectată la glucoză s-a bazat pe rezultatele unui test de toleranță orală la glucoză de 75 g conform criteriilor Asociației Americane a Diabetului (9). T2D a fost definit de 120 de minute de glucoză ≥11,1 mmol/L sau de o glucoză plasmatică repetată în repaus alimentar ≥7,0 mmol/L.

Practic, toți pacienții cu diabet zaharat au fost tratați cu metformină și unii, după caz, cu un inhibitor al dipeptidil peptidazei. Doar aceste medicamente au fost utilizate pentru tratamentul diabetului în aceste cohorte. Pacienții cu colesterol crescut și/sau tensiune arterială au primit medicamente regulate, după cum este necesar.

Diagnosticul NAFLD/NASH

În cohorta umană pentru care au fost disponibile biopsii paralele de ficat și țesut adipos, NAFLD și NASH au fost determinate și diagnosticate histologic (utilizând diapozitive colorate cu hematoxilină și eozină și tricrom Masson) în urma unei propuneri anterioare de gradare și stadializare a leziunilor histologice detectate. în biopsiile hepatice (10). În conformitate, doi patologi hepatici independenți și specializați de la Universitatea din Leipzig au evaluat leziunile histologice - steatoza, balonarea și inflamația intraacinară și portală - și au rezumat cele din scor (11).

Detectarea Gremlin 1 în ser uman

Sandwich ELISA a fost utilizat pentru a măsura nivelurile serice umane de Gremlin 1 din probe. Gremlin 1 a fost capturat folosind un anticorp monoclonal dezvoltat intern împotriva lui Gremlin 1 (MedImmune, Gaithersburg, MD) pe o placă cu jumătate de zonă cu 96 de godeuri. Probele au fost incubate timp de 1 până la 2 ore urmate de detectarea cu anticorp policlonal de iepure (număr de catalog ab157576; Abcam) timp de 1 oră. Policlonalul de iepure a fost detectat utilizând peroxidază de hrean generată intern - anticorp policlonal anti-iepure conjugat. Nivelurile Gremlin 1 din probe au fost interpolate utilizând curba standard generată în 50% ser imun-epuizat.

Experimente bazate pe celule

Adipocite umane primare

Adipocitele umane primare au fost izolate așa cum s-a descris anterior (12). Pe scurt, țesuturile adipoase subcutanate, obținute prin biopsie cu ac, au fost digerate cu colagenază tip II (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) timp de 60 de minute la 37 ° C în baie de apă agitată. Adipocitele au fost apoi filtrate printr-o plasă de nailon de 250 μm și spălate de patru ori, urmate de măsurarea dimensiunii celulei, extracții de ARN/proteine ​​și/sau teste experimentale suplimentare. Pentru semnalizarea insulinei și evaluările absorbției de glucoză, adipocitele au fost incubate în continuare în mediul Hank 199, pH 7,4 (Life Technologies, Carlsbad, CA) conținând 4% BSA cu sau fără 6 mmol/L glucoză, respectiv.

Pentru absorbția glucozei, adipocitele au fost pretratate cu IgG sau anticorp anti-Gremlin 1 (MedImmune) și/sau Gremlin 1 recombinant (200 ng/ml) (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) timp de 3 ore și stimulate cu 10 nmol/L insulină timp de 15 minute înainte de adăugarea de glucoză D- [U- 14 C] (0,26 mCi/L; concentrație finală 0,86 μmol/L) (PerkinElmer, Waltham, MA) timp de 45 de minute suplimentare. Absorbția glucozei a fost imediat oprită prin separarea adipocitelor de mediu și radioactivitatea încorporată a fost măsurată într-un contor de scintilație.

Celulele musculare scheletice primare

Celulele satelit au fost izolate de la cinci donatori cu NGT. Celulele au fost crescute până la confluență> 80% în DMEM/F12 conținând 10% FBS și antibiotice și diferențiate în miotuburi multinucleare în mediu de diferențiere (DMEM, Mediu 199, HEPES, sulfat de zinc, vitamina B12, FBS și antibiotice) așa cum este descris 13 ). Celulele au fost apoi înfometate timp de 4 ore înainte de incubare cu Gremlin 1 recombinant (50 ng/mL) și insulină (1-10 nmol/L).

Hepatocite umane

Hepatocitele umane primare, HiPS-Hep (Takara Bio Inc., Shiga, Japonia), au fost cultivate în mediu hepatocitar (Takara Bio) conform instrucțiunilor producătorului. Celulele au murit de foame cu 3 ore înainte de pretratarea cu Gremlin 1 recombinant (50 ng/mL) și insulină (100 nmol/L).

Celulele hepatice HepG2 (ATCC, Manassas, VA) și IHH (celule hepatocitare umane) au fost cultivate în DMEM (Lonza, Basel, Elveția) suplimentate cu 10% FBS și antibiotice. Pentru a studia efectele secretorii ale Gremlin 1, celulele HepG2 au fost transfectate cu plasmide wt.Grem1.myc sau trunc.Grem1.myc (exprimând eticheta myc fuzionată la terminalul COOH al Gremlin 1 uman cu sau fără peptida semnal N-terminală secvență) construită în laboratorul nostru. Pentru imagini confocale, celulele au fost crescute pe diapozitive de cameră de sticlă (Thermo Fisher Scientific) timp de 72 de ore. Celulele au fost apoi spălate cu PBS, fixate cu 4% formaldehidă, permeabilizate cu 0,1% Triton, blocate cu 20% ser de capră (1 oră) și incubate cu anticorp anti-mic (Sigma-Aldrich) timp de 3 ore. După spălare cu PBS și incubare cu anticorp secundar sondat Alexa 488 timp de 1 oră, celulele au fost montate cu soluție de montare Vectashield conținând DAPI (Vector Laboratories, Inc). Imaginile confocale au fost apoi colectate cu microscopul confocal Leica SP5.

Pentru a studia efectul inhibitorului proteinei tirosin fosfatazei 1B (PTP1B) (CAS 765317–72–4; Merck Millipore, Danvers, MA), IHH-urile au fost înfometate și pretratate cu inhibitorul (10 μmol/L) cu sau fără Gremlin 1 recombinant ( 200 ng/mL) timp de 24 ore, urmată de insulină (10 nmol/L) timp de 10 minute.

PCR cantitativ în timp real

ARNm a fost extras din celule și țesuturi urmat de sinteza ADNc. Expresia genică a fost apoi analizată utilizând sistemul QuantStudio 6 Flex TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA). Cuantificarea relativă a expresiei genice a fost normalizată la 18S rARN sau HPRT1. Primerii și sondele au fost fie proiectate, fie comandate comercial, ca seturi de probe TaqMan predefinite (test la cerere; Applied Biosystems).

Imunoblotarea

Analiza Western blot a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (14). Au fost utilizați următorii anticorpi primari: Gremlin 1 (MedImmune), pAktS473, AKT (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pY20, IRβ (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) și IRS1 (Merck Millipore).

Analiza activității PTP1B

Activitatea PTP1B a fost evaluată utilizând setul de testare a activității PTP (Millipore). Pe scurt, IHH-urile au fost lizate în tampon de liză lipsit de ortovanadat de sodiu. PTP1B a fost apoi imonoprecipitat folosind un anticorp PTP1B (Millipore). Măsurarea activității PTP1B a fost efectuată utilizând fosfepteptida de tirozină sintetică (TSTEPQpYQPGENL). Eliberarea fosfatului a fost măsurată la OD 650 nmol/L utilizând reactivul verde malachit furnizat împreună cu kitul.

Analize statistice

Datele experimentale sunt prezentate ca medii ± SD sau medii ± SEM. Semnificația este indicată în cifre ca P 2, vârstă 34 ± 9 ani) și FDR (IMC 24,9 ± 2,3 kg/m 2, vârstă 38 ± 8 ani) la subiecții cu T2D, GREMLIN 1 mRNA a fost semnificativ mai mare în țesutul adipos subcutanat din acest subgrup FDR cu risc ridicat în comparație cu grupul de control potrivit (Fig. 1A). În plus, nivelurile de GREMLIN 1 au fost corelate pozitiv cu procentul de grăsime corporală și rezistența la insulină măsurate ca HOMA-IR (Fig. 1B și C). FDR-urile, ca grup, sunt mai rezistente la insulină decât un grup non-FDR asociat cu IMC.