Contribuit de George M. Church, 20 august 2019 (trimis spre examinare 20 iunie 2019; revizuit de Aubrey de Gray și Joao Pedro Magalhaes)

multe

Acest articol are o corecție. Te rog vezi:

Semnificaţie

Longevitatea umană și animală este legată direct de sănătatea lor. În timp ce studiile anterioare au furnizat dovezi care susțin această conexiune, implementarea terapeutică a acestor cunoștințe a fost limitată. În mod tradițional, bolile sunt cercetate și tratate individual, ceea ce ignoră interconectarea afecțiunilor legate de vârstă, necesită tratamente multiple cu substanțe fără legătură și crește riscul acumulativ de efecte secundare. În acest studiu, abordăm și depășim acest impas prin crearea de terapii genice antiaging bazate pe virusul adeno-asociat (AAV) pentru tratamentul simultan al mai multor boli legate de vârstă. Demonstrăm natura modulară și extensibilă a terapiei genetice combinate testând cocktail-uri terapeutice AAV care se confruntă cu boli multiple într-un singur tratament. Am observat că 1 tratament cuprinzând 2 terapii genetice AAV a fost eficient împotriva tuturor celor 4 boli.

Abstract

În această lucrare, am dezvoltat și testat 3 terapii genetice bazate pe AAV și le-am administrat șoarecilor adulți netransgenici pentru tratamentul a 4 boli legate de vârstă. Cele 3 gene implicate în aceste terapii au fost factorul de creștere a fibroblastelor 21 (FGF21), αKlotho și factorul de creștere transformator-β1 (TGFβ1). Aceste 3 gene au fost alese datorită rolului lor benefic cunoscut în îmbătrânirea și stările specifice ale bolii (4 ⇓ –6). FGF21 și αKlotho sunt factori circulanți produși de ficat și, respectiv, de rinichi (5, 13 ⇓ –15), iar TGFβ1 este un factor secretat cu expresie care nu se limitează la un anumit organ (16). FGF21 a stabilit roluri în metabolismul și manipularea glucozei (17), αKlotho este un regulator cunoscut al calciului intracelular și oferă protecție în patologiile cardiace și renale (18, 19), iar semnalizarea TGFβ1 joacă un rol important în cardiomiopatia hipertrofică legată de vârstă, recrutarea și formarea matricei extracelulare (20). Deși aceste 3 gene au roluri cunoscute în diferite stări de boală asociate vârstei, rămâne necunoscut dacă perturbarea lor simultană ar oferi un fenotip aditiv, sinergic sau dăunător în orice boală dată.

Rezultate

Am selectat AAV ca metodă de livrare a terapiei genice datorită siguranței sale, imunogenității scăzute, ușurinței de fabricație, capacității de a infecta celulele care se divid și care nu se divid și un număr tot mai mare de studii clinice cu succes la om (21 ⇓ –23). Am început prin crearea a 3 vectori AAV8 separați pentru supraexprimarea mouse-ului FGF21, o formă solubilă a mouse-ului care transformă factorul de creștere-receptorul β 2 (sTGFβR2) care leagă și reprimă TGFβ1 (24) și mouse-ul αKlotho (Metode și SI Anexă, Fig. S1A) . Serotipul AAV8 a fost ales ca vector de livrare datorită ratei ridicate de infecție a ficatului (25), un organ bine cunoscut pentru capacitatea sa de a produce niveluri ridicate de proteine ​​secretate (26) și țesutul natural pentru expresia endogenă a FGF21 (4) . După generarea și injectarea fiecărui virus, am verificat supraexprimarea transgenelor corespunzătoare direct sau din efectul lor din aval în plasma de șoarece folosind testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) și Western blots (Metode și SI Anexă, Fig. S1 B - D) și a constatat până la o creștere de până la 17 ori a FGF21, o scădere de 95% a TGFβ1 circulant și o creștere de ~ 10 × a αKlotho circulant. De asemenea, am efectuat necropsii complete la șoareci injectați cu terapiile noastre și nu s-au observat constatări patologice remarcabile, sugerând niciun efect nociv în comparație cu șoarecii martor.

Administrarea sistemică de AAV a terapiei genetice combinate inversează simptomele diabetului la șoareci pe un HFD. (A) GTT de șoareci a postit peste noapte timp de 8 ore. Glucoza din sânge măsurată la 0, 15, 30, 60 și 120 min după gavajul oral de 50 mg glucoză. (B) Zona sub curba (ASC) GTT. (C) ITT de șoareci postit timp de 6 ore. Glicemia s-a măsurat la 0, 15, 30, 60 și 120 min după injectarea subcutanată a 0,5 UI/kg insulină. (D) ASC ale ITT. (E) HOMA-IR. (F) HOMA-β. (G) Măsurători de insulină de post la șoareci postite timp de 8 ore peste noapte înainte de GTT. n = 10 pentru șoareci AAV: GFP ND și n = 12 pentru șoareci AAF: GFP și AAV: FGF21 HFD. Testele statistice în B și D - G sunt ANOVA cu un singur sens. Barele de eroare reprezintă SEM. C, control; F, FGF21; K, αKlotho; T, sTGFβR2; TF, sTGFβR2 + FGF21; TFA, sTGFβR2 + FGF21 + aKlotho; TK, sTGFβR2 + αKlotho; FK, FGF21 + αKlotho. * P † P ⇓ ⇓ –43). Al treilea model de boală utilizat pentru evaluarea terapiilor unice și combinate a folosit obstrucția unilaterală ureterală (UUO), un mijloc stabilit de simulare a fibrozei renale progresive, care este o caracteristică a bolii renale (44). Am injectat șoareci cu terapii genetice unice și combinate 1 săptămână înainte de inducerea bolii prin UUO, iar rinichii au fost recoltați și analizați pentru fibroză și remodelare 1 săptămână după procedura UUO. Imaginile cu rinichi întregi colorate cu colorarea Masson’s Trichrome (MTS) au arătat că supraexpresia αKlotho a fost capabilă să prevină deteriorarea medularei renale și subțierea cortexului renal în comparație cu martorii (Fig. 3 A și B). În mod surprinzător, cea mai mare atenuare a atrofiei medulare s-a datorat combinației de AAV: sTGFβR2 și AAV: FGF21, care au avut rezultate semnificativ mai bune decât AAV: αKlotho la prevenirea atrofiei medulare renale, cu doar 6,4% atrofie comparativ cu 22,5%, respectiv (P † P

Metode

Construcție vectorială.

Numerele de acces ale Centrului Național pentru Informații despre Biotehnologie (NCBI) pentru FGF21, αKlotho și TGFβR2 sunt 56636, 16591 și respectiv 21813.

Producția de viruși.

AAV a fost creat folosind tripla transfecție a celulelor HEK293T și purificarea gradientului de iodixanol așa cum s-a descris anterior. Pe scurt, celulele HEK293T au fost transfectate folosind PEI max (1 mg/ml) la un raport de 4: 1 la ADN. Plasmida auxiliară, capsida și gena de interes (plasmida repetată terminală inversată) au fost transfectate la un raport molar 2: 1: 1. Mediile și celulele au fost colectate 72 h posttransfecție. Celulele au fost lizate cu 3 x îngheț - dezgheț, tratate cu benzonază timp de 45 de minute, centrifugate pentru a îndepărta resturile celulare înainte de a fi combinate cu mediul și filtrate printr-un filtru de 0,2 um; 40% polietilen glicol 8000 a fost adăugat la o concentrație finală de 8%. Virusul care conține mediu a fost agitat timp de 1 oră la 4 ° C și apoi, lăsat peste noapte. Mediile au fost apoi rotite la 3.000 × g timp de 20 de minute, iar supernatantul a fost aruncat. Precipitatul a fost resuspendat în 5 ml de soluție salină tamponată 1 × fosfat (PBS) și a fost acoperit cu un gradient de iodixanol (15, 25, 40 și 60%) în tuburi de etanșare optică (BECKMAN COULTER). Apoi, a fost ultracentrifugat la 250.000 × g timp de 1 oră în BECKMAN COULTER VTi50. Fracțiunea de 40% a fost colectată și spălată de 5 ori cu 1 × PBS conținând 0,001% PLURONIC F65 (SIGMA) și stocată în 1 × PBS cu 5% sorbitol și 0,001% PLURONIC F65 la -80 ° C.

qPCR, ELISA, Western Staining și Immunostaining.

Virusul a fost titrat folosind qPCR cu TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) într-o regiune comună de 3 ′ a tuturor vectorilor din WPRE3 (element de reglementare posttranscripțional woodchuck): primer direct: 5′-CTTCCCGTATGGCTTTCATTTT, primer invers: 5′-GCCGTGGCA, și sondă: 5′-FAM-TCCTCCTT-ZEN-GTATAAATC-IBFQ (sondă personalizată IDT). ELISA au fost efectuate pentru șoarece TGFb1 și șoarece FGF21 (ABCAM ab119557; ab212160). Anticorpul utilizat pentru αKlotho este AF1819 de la R&D SYSTEMS. αSMA a fost colorat folosind ab5694 din ABCAM. Aglutinina din germeni de grâu (WGA) a fost de la ABCAM 20528, iar DAPI a fost de la SIGMA. Probele au fost fixate în formalină timp de 24 de ore și apoi au fost încorporate parafină.

OGTT, ITT și PTT.

Toți șoarecii primiseră o terapie AAV sau un virus de control ~ 30 d înainte de testarea acestor parametri și fuseseră pe un HFD timp de ~ 4 până la 5 luni. Șoarecii au fost postiti peste noapte timp de 8 ore pentru testul oral de toleranță la glucoză (OGTT) și testul de toleranță la piruvat (PTT). Șoarecii au fost posti doar 6 ore pentru testul de toleranță la insulină (ITT). Acestea au fost efectuate așa cum s-a descris anterior. Pe scurt, după post, a fost măsurată glicemia inițială; s-a administrat un bolus oral de 500 mg glucoză pentru OGTT, s-a administrat intraperitoneal o doză de 2 g/kg de piruvat sau s-a administrat intraperitoneal o doză de 0,5 UI/kg de insulină. Glicemia a fost măsurată la intervale de 15, 30, 60 și 120 de minute. Șoarecii care erau pe un ND au primit o doză de 1-UI/kg de insulină. Când au văzut că toți șoarecii FGF21 se prăbușesc sub 40 mg/dL după 30 de minute, restului șoarecilor HFD li s-a administrat o doză mai mică de 0,5 UI/kg. Au fost folosite un monitor de glucoză One Touch Ultra și benzi negre.

Șoarecii au fost așezați pe tampoane de încălzire cu temperatură controlată menținute la 37 ° C. Șoarecii au fost poziționați cu capul și gâtul complet extinse pentru a asigura o cale respiratorie patentată. Temperatura șoarecilor și a tampoanelor termice au fost controlate la 37 ° C printr-o sondă rectală care monitorizează temperatura corpului pe durata procedurii. UUO a fost realizat prin expunerea rinichiului stâng prin flancul stâng. Ureterul a fost obstrucționat complet în apropierea pelvisului renal folosind o cravată de poliester de mătase 4-0 Ethibond împletită la 2 puncte. Pielea a fost capsată folosind capse sterile. Nu s-au folosit suturi. Șoarecii au fost apoi eutanasiați la 7 sau 14 zile postchirurgie, iar țesuturile și sângele au fost colectate pentru analiză. Șoarecii au fost randomizați și orbiți de către chirurgi, astfel încât să nu știe ce șoareci au primit care terapie.

ECHO-uri.

Acestea au fost efectuate așa cum a fost descris anterior în „Ecocardiografia transtoracică la șoareci” de Respress și Wehrens (52). Pe scurt, șoarecii au fost anesteziați și Naired. Apoi, gelul cu ultrasunete preîncălzit a fost aplicat pe piept peste inimă și s-au făcut imagini. Șoarecii au fost randomizați și orbiți de către tehnicieni astfel încât să nu știe ce șoareci au primit care terapie.

Cuantificarea imaginilor.

Imagini ale unor organe întregi au fost realizate la 10 ×, cusute împreună utilizând software-ul Zen Zeiss și analizate folosind software-ul MATLAB personalizat. Software-ul MATLAB a folosit instrumentul de prag de culoare pentru a selecta mai întâi culorile pixelilor de interes și apoi, pentru a exporta acest cod ca cod care poate fi folosit ca apel funcțional pentru toate imaginile ulterioare. Scriptul a salvat numărul de pixeli și le-a exportat ca fișier text. Rapoartele au fost calculate prin simpla împărțire a petelor interesate vs. aria totală a organului. Suprafața totală a organului a fost obținută prin pragul tuturor culorilor vs. fundalul alb care înconjoară organul.