Cercetarea lipidelor și a acizilor grași

Editat de
Anna M. Giudetti

Universitatea din Salento, Italia

Revizuite de
Rhys D. Evans

Universitatea din Oxford, Regatul Unit

Daniele Vergara

Universitatea din Salento, Italia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

obezitatea

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • Departamentul de Științe Nutritive, Universitatea Purdue, West Lafayette, IN, Statele Unite

Introducere

Enterocitele, celulele absorbante ale intestinului subțire, sunt responsabile pentru absorbția, reambalarea și secreția grăsimilor din dietă. În plus, enterocitele sunt capabile să depoziteze temporar grăsimi dietetice în CLD în răspunsul postprandial la grăsimile dietetice (revizuite în Beilstein și colab., 2016; D’Aquila și colab., 2016). Grăsimea alimentară sub formă de TAG este digerată în lumenul intestinului subțire producând acizi grași liberi și monoacilgliceroli, care sunt încorporați în micelele mixte. Micelele mixte interacționează cu membrana de la marginea periei a enterocitelor unde sunt absorbiți acizii grași liberi și monoacilglicerolii. În enterocit, acizii grași liberi și monoacilglicerolii sunt resintetizați în TAG de acil-CoA: monoacilglicerol aciltransferază și DGAT la nivelul reticulului endoplasmatic (ER). TAG-ul rezultat poate fi ambalat pe o particulă de chilomicron pentru secreție sau stocat temporar în CLD. În timp ce există asemănări structurale și de compoziție între particulele de chilomicron și CLD, aceste particule care conțin lipide diferă prin sinteza și metabolismul lor, permițând secretarea chilomicronilor și necesită un metabolism suplimentar al CLD înainte ca lipidele stocate să fie utilizate în interiorul sau în cele din urmă secretate din celule (revizuite în Demignot și colab., 2014).

Picăturile de lipide citoplasmatice sunt compuse dintr-un nucleu lipidic neutru, un monostrat fosfolipidic și proteine ​​asociate (Beilstein și colab., 2016). Se crede că proteinele care se asociază cu CLD reglează stocarea și mobilizarea TAG. Proteinele asociate cu CLD izolate din enterocite după o provocare lipidică au fost identificate de proteomică vizată (Seyer și colab., 2013) și globală (Bouchoux și colab., 2011; Beilstein și colab., 2013; D'Aquila și colab., 2015 ) abordari. Aceste studii au identificat și confirmat că membrii familiei Perilipin (Plin) (Plin2 și Plin3) se asociază cu CLD. În mod interesant, aceste studii au identificat, de asemenea, proteinele asociate cu o mare varietate de căi biologice, inclusiv căile lipidice catabolice și anabolice.

Efectul obezității asupra metabolismului lipidelor intestinale este în prezent neclar; cu toate acestea, cercetările sugerează că este neregulat în această stare metabolică, precum și în alte stări de boală (revizuite în Dash și colab., 2015; Xiao și colab., 2018). Studii recente în regim alimentar bogat în grăsimi (non-obezi), ob/ob șoarecii și șoarecii DIO au demonstrat rate scăzute de secreție TAG în răspunsul postprandial la grăsimea alimentară (Douglass și colab., 2012; Uchida și colab., 2012). În plus, DIO modifică nivelurile de ARNm intestinal ale proteinelor implicate în asamblarea chilomicronului, sinteza TAG și traficul de acizi grași (Uchida și colab., 2012).

Se știe puțin despre efectul obezității asupra morfologiei CLD și proteinelor asociate în enterocite. DIO modifică proteomul CLD în adipocite și hepatocite (Ding și colab., 2012; Khan și colab., 2015). Studiile anterioare au arătat modificări ale nivelurilor de ARNm ale proteinelor despre care se știe că se asociază cu CLD, inclusiv lipaze (Uchida și colab., 2012) și membrii familiei Plin (Lee și colab., 2009). În enterocite, Plin2 și 3 se localizează la CLD în răspunsul postprandial la grăsimile din dietă; cu toate acestea, localizarea lor variază în diferite condiții fiziologice. Plin3 se localizează la CLD ca răspuns la o provocare dietetică a grăsimilor definită ca 2 ore după administrarea unui gavaj oral de 200 μl de ulei de măsline. Plin2 se localizează la CLD ca răspuns la hrănirea cronică cu conținut ridicat de grăsimi într-un model de șoarece DIO (Lee și colab., 2009). Nu a fost efectuată o analiză cuprinzătoare a proteinelor asociate cu CLD de la șoareci slabi și DIO în răspunsul postprandial la grăsimile din dietă.

Pentru a determina efectele DIO asupra morfologiei enterocite CLD și proteomului în răspunsul postprandial la grăsimile dietetice, am investigat CLD-urile din enterocitele șoarecilor slabi și DIO cărora li s-a administrat oral un bolus de ulei prin microscopie electronică de transmisie, microscopie imunofluorescentă și analiză proteomică. Pe baza observațiilor anterioare ale secreției TAG modificate la șoareci DIO ca răspuns la o provocare dietetică a grăsimilor (Douglass și colab., 2012; Uchida și colab., 2012), facem ipoteza că șoarecii DIO au modificat morfologia CLD și proteomul CLD.

Materiale și metode

Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu Ghidul Institutului Național de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator și aprobat de Comitetul Purdue pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor. C57BL/6 șoareci masculi dintr-o colonie de reproducere internă au fost folosiți pentru acest studiu. Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă chow (PicoLab 5053, Lab Diets, Richmond, IN, Statele Unite) care conține 62,1% din calorii din carbohidrați (amidon), 24,7% din proteine ​​și 13,2% din grăsimi de la înțărcare până la 5 săptămâni de vârstă. Șoarecii au fost găzduiți într-o instalație controlată de temperatură și umiditate cu un ciclu de 12 ore lumină/întuneric (6 AM/6 PM) cu ad libitum acces la alimente și apă.

Generarea modelului DIO Mouse

C57BL/6 șoareci masculi au fost hrăniți fie cu diete bogate în grăsimi, fie cu conținut scăzut de grăsimi. Dieta bogată în grăsimi (D12492, Research Diet, New Brunswick, NJ, Statele Unite) constă în 20% din calorii din carbohidrați, 20% din proteine ​​și 60% din grăsimi. Dieta cu conținut scăzut de grăsimi, D12492 (D12450J, Research Diet, New Brunswick, NJ, Statele Unite) constă în 70% din calorii din carbohidrați, 20% din proteine ​​și 10% din grăsimi. Șoarecii au fost hrăniți cu dieta timp de 12 săptămâni, iar greutățile corporale au fost monitorizate săptămânal.

Procedura mouse-ului pentru izolarea CLD și analiza proteomică

Cinci șoareci din grupul cu dietă cu conținut scăzut de grăsimi și cinci șoareci din grupul cu dietă cu conținut ridicat de grăsimi au fost postite timp de 4 ore la începutul ciclului de lumină. A fost administrat un gavaj oral de 200 μl de ulei de măsline și 2 ore mai târziu, șoarecii au fost eutanasiați prin asfixiere cu CO2. Intestinul subțire a fost excizat și împărțit în trei segmente de lungime egală. Segmentul de mijloc, reprezentând jejunul, a fost utilizat pentru analiză.

Izolarea enterocitelor

Enterocitele au fost izolate din secțiunea mijlocie a intestinului subțire așa cum s-a descris anterior (Xie și colab., 2003; Lee și colab., 2009; D’Aquila și colab., 2015). Pe scurt, secțiunile intestinale au fost spălate în tampon de țesut (soluție de sare echilibrată Hank cu 25 mM HEPES și ser fetal de vițel 1%) și apoi plasate în tampon de izolare (soluție de sare echilibrată Hank’s fără calciu și magneziu cu 1,5 mM EDTA). Segmentele intestinale au fost incubate timp de 15 minute la 37 ° C cu rotație. Proba a fost vortexată scurt și supernatantul care conține enterocite a fost îndepărtat și salvat. Procesul a fost repetat și supernatanții care conțin enterocite izolate au fost combinate.

Izolarea CLD

Picăturile de lipide citoplasmatice au fost izolate din enterocite utilizând un protocol de ultracentrifugare cu gradient de zaharoză stabilit anterior (D’Aquila și colab., 2015). Enterocitele au fost lizate în tampon de liză zaharoză rece ca gheața (175 mM zaharoză, 10 mM HEPES și 1 mM EDTA pH 7,4). Celulele au fost întrerupte prin trecerea printr-un ac de 1-inch de calibru 27, de opt ori. 2 ml de lizat celular rezultat au fost stratificate cu grijă cu 6 ml tampon de liză fără zaharoză și centrifugate la 20.000 × g la 4 ° C timp de 2 ore. După centrifugare, proba a fost înghețată la -80 ° C. Proba înghețată a fost tăiată în șapte fracțiuni secvențiale care aveau o lungime de aproximativ 1 cm. Fracția superioară a fost utilizată ca CLD izolate. Această procedură a fost validată anterior prin imunoblotare pentru anticorpi specifici fracției celulare și microscopie electronică cu colorare negativă a CLD-urilor izolate (D’Aquila și colab., 2015).

Digestie în soluție și LC-MS/MS

Identificarea proteinelor

Citare: D’Aquila T, Zembroski AS și Buhman KK (2019) Obezitatea indusă de dietă modifică morfologia picăturilor lipidice citoplasmatice intestinale și proteomele în răspunsul postprandial la grăsimile dietetice. Față. Fiziol. 10: 180. doi: 10.3389/fphys.2019.00180

Primit: 02 octombrie 2018; Acceptat: 13 februarie 2019;
Publicat: 05 martie 2019.

Anna Maria Giudetti, Universitatea din Salento, Italia

Rhys David Evans, Universitatea din Oxford, Regatul Unit
Daniele Vergara, Universitatea din Salento, Italia