Abstract

fundal

Poliartrita reumatoidă (RA) este o boală autoimună caracterizată prin sinovită. Pien Tze Huang (PZH) este un medicament cu brevet chinezesc, cu efecte antiinflamatorii și imunomodulatoare. Cu toate acestea, dacă PZH ar putea fi utilizat în terapia RA este încă necunoscut. Prin urmare, acest studiu și-a propus să investigheze efectul terapeutic și mecanismul potențial al PZH asupra șoarecilor artrite induse de colagen (CIA).

Metode

Șoarecii masculi DBA/1J au fost folosiți pentru a stabili un model animal de CIA și apoi tratați cu doze diferite de PZH timp de 4 săptămâni. Efectul terapeutic al PZH asupra șoarecilor CIA a fost evaluat prin scorul de artrită, colorarea patologică și detectarea nivelurilor factorilor inflamatori din ser și articulații. Pentru investigarea mecanismului său posibil, au fost detectate activitatea căii de semnalizare NF-κB, inflammasomul NLRP3 și nivelul A20.

Rezultate

Rezultatele au arătat că PZH ar putea atenua eritemul și umflarea labelor posterioare ale șoarecilor CIA, îmbunătăți condițiile patologice ale articulației și scade producția de IL-1β, IL-6 și IL-17 în ser și articulații. Mai mult, PZH ar putea inhiba în mod semnificativ activitatea căii de semnalizare NF-κB și inflammasomul NLRP3 în articulația gleznei șoarecilor CIA, comparativ cu grupul model. De asemenea, a crescut nivelul de A20 în articulația gleznei șoarecilor CIA.

Concluzie

Acest studiu a indicat că PZH ar putea atenua inflamația articulară a șoarecilor CIA, iar mecanismul ar putea fi legat de reglarea căii de semnalizare NF-κB și inflammasomul NLRP3.

fundal

Poliartrita reumatoidă (RA) este o boală inflamatorie caracterizată prin hiperplazie sinovială extinsă și infiltrare celulară inflamatorie, care provoacă în cele din urmă leziuni osoase și dizabilități articulare funcționale [1]. Citokinele pro-inflamatorii precum IL-1β, IL-6 și IL-17 produse de sinovocite și celulele imune infiltrante sunt puternic asociate cu patogeneza RA [2]. Ar putea activa alți mediatori inflamatori precum INF-γ, iNOS și COX-2, inflamație sinovială îmbunătățită sinergic, ducând în cele din urmă la deteriorarea articulațiilor [3]. Multe căi de semnalizare au fost implementate pentru a implica reglarea producției de citokine pro-inflamatorii în RA. Pe lângă calea clasică de semnalizare NF-κB, inflammasomul cu conținut de 3 (NLRP3) al familiei receptorului NOD-like în progresul patologic al RA a obținut treptat îngrijorări [4, 5]. Activarea inflammasomului NLRP3 a influențat nu numai expresia IL-1β și IL-18, ci și activarea căii de semnalizare NF-κB [6, 7]. Transmiterea acestor semnale inflamatorii a indicat, de asemenea, complexitatea procesului patologic RA.

Medicamentele clinice pentru RA includ medicamente antiinflamatoare nesteroidiene (AINS), glucocorticoizi și mai mulți agenți biologici, care au diferite grade de eficacitate și efecte secundare [8]. Prin urmare, medicamentele sigure și eficiente sunt încă necesare în tratamentul RA. Medicamentele tradiționale chinezești (TCM) sunt comoara pentru descoperirea de noi medicamente. Unele TCM au fost utilizate pentru a trata pacienții cu RA în clinică cu o eficacitate bună, cum ar fi Wu-Tou Decoction și Yi Shen Juan Bi Pill [9, 10].

Pien Tze Huang (PZH), o binecunoscută formulă tradițională chineză, constă din Notoginseng Radix și Rhizoma (Tianqi sau Sanqi), calcul bovis (Niuhuang sau calculul biliar al bouului), Shedan (calculul biliar al șarpelui) și moscul [11]. A fost folosit în China și Asia de Sud-Est de secole ca remediu popular pentru diferite boli legate de inflamație, cum ar fi hepatita. S-a dovedit că PZH a exercitat efect antiinflamator prin reglarea procentului de celule Th1 și Th17, reducând expresia IL-17, IL-23 și IFN-γ și reglând căile de semnalizare NF-κB și STAT la animalele model inflamatorii [11, 12]. Recent, unele componente medicinale ale Notoginseng Radix și Rhizoma au fost raportate că au un efect remarcabil în tratarea șoarecilor sau șobolanilor cu artrită indusă de colagen (CIA), un model animal clasic RA [13, 14]. În plus, ginsenosidul Rg1 și compusul metabolit al ginsenozidului K ar putea regla în mod semnificativ inflammasomul NLRP3 și translocația nucleară NF-κB [14, 15]. Pe baza acestor studii, am emis ipoteza că PZH ar putea avea un efect terapeutic asupra șoarecilor CIA. Prin urmare, această cercetare a vizat explorarea potențialului terapeutic și a mecanismului posibil al PZH pe șoareci CIA.

Metode

Droguri

PZH a fost produs de Zhangzhou Pien Tze Huang Pharmaceutical Co., Ltd., (Zhangzhou, China; aprobarea FDA nr. Z35020243). Probele de medicament au fost identificate și caracterizate prin HPLC - MS/TOF ca publicația noastră anterioară [12]. Soluția stoc de PZH a fost preparată prin dizolvarea pulberii PZH în apă purificată și proba a fost complet amestecată din nou înainte de utilizare.

Animale

Șoareci masculi DBA/1J de 6-8 săptămâni au fost obținuți de la Beijing Vital River Laboratories (Beijing, China). Șoarecii au fost hrăniți cu hrană și apă ad libitum și apoi li s-a permis să se aclimatizeze timp de 1 săptămână înainte de inițierea experimentului. Toate protocoalele utilizate aici au primit aprobarea de la Comitetul de etică al cercetării al Institutului de teorie de bază a medicinei chineze, Academia Chineză de Științe Medicale din China.

Inducerea CIA

Colagenul de tip II bovin (CII, 2 mg/ml; Chondrex, Redmond, WA, SUA) a fost diluat într-un volum egal de adjuvant Freund complet (Chondrex). Șoarecii au fost mai întâi imunizați cu 100 μL emulsie conținând 100 μg CII prin injecție intradermică în coadă și urmată de o imunizare de rapel în ziua 21 [16]. Debutul CIA a putut fi observat între ziua 28 și ziua 32 după prima imunizare.

Tratament

Am împărțit șoarecii cu inducere cu succes a modelului CIA în șase grupuri (șase șoareci pe grup), care erau grup normal, grup model, grup cu doză mică PZH (PZH-L, 0,078 g/kg/zi), grup cu doză medie PZH PZH -M, 0,234 g/kg/zi, egală cu doza clinică), grupul cu doză mare PZH (PZH-H, 0,702 g/kg/zi) și grupul cu metotrexat (MTX, 0,3 mg/kg/zi, stabilit ca anterior descris [17]). Apa purificată (grup normal, grup model), MTX și PZH au fost administrate intragastric în fiecare zi la un volum de 1 ml/100 g timp de 4 săptămâni.

Scorul artritei

Scorul artritei a fost măsurat de două ori pe săptămână. Scorul artritei pentru fiecare articulație a gleznei a fost înregistrat de aceiași observatori, care erau orbi la tratamentul primit de animale, așa cum a fost descris anterior. Scorul a fost efectuat cu o scară 0-4, scorurile artritei au fost realizate ca: 0 = fără schimbare; 1 = labă cu umflare ușoară la un singur membru; 2 = mai mult de o labă cu umflături; 3 = toată laba cu umflare și eritem evident; și 4 = laba întreagă cu umflături severe. Scorul maxim al fiecărui șoarece a fost de 16 [18].

ELISA

Probele au fost preparate din șoareci de ser. Nivelurile de IL-1β, IL-6 și IL-17 în serul șoarecilor au fost determinate de ELISA folosind truse comerciale (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) conform protocolului producătorului.

Determinarea biochimică a sângelui

Alanina aminotransferaza (ALT), aspartatul aminotransferaza (AST), creatinina (CREA) și ureea (UREA) din serul șoarecilor au fost testate cu kituri comerciale biochimice din sânge de către un analizor biochimic automat Hitachi 7160 din Japonia.

Histopatologie

Secțiunile (3 μm) au fost preparate și colorate cu hematoxilină și eozină (H&E). Caracteristicile histopatologice au fost evaluate și punctate în condiții de orbire în conformitate cu următorul sistem: 0, nicio modificare detectabilă; 1, infiltrat focal minor; 2, infiltrat moderat; 3, infiltrat sever, dar fără panus sau eroziune a cartilajului; și 4, infiltrat foarte sever plus eroziune și fibroză a panoului sau cartilajului [19]. Scorul a fost realizat orbește de trei observatori independenți.

Imunohistochimie

Secțiunile au fost incubate respectiv cu anti-IL-1β (diluție 1: 1000, Abcam, Cambridge, Marea Britanie), anti-IL-6 (diluție 1: 1000, Abcam, Cambridge, Marea Britanie), anti-IL-17 (diluție 1: 200, Abcam, Cambridge, Marea Britanie) și anti-A20 (diluare 1: 200, Abcam, Cambridge, Marea Britanie) peste noapte la 4 ° C, urmată de eclozare cu anticorp secundar conjugat cu peroxidază de ridiche de cal biotinilată timp de 30 de minute la temperatura camerei ( ZSGB-BIO, Beijing, China). Colorarea peroxidazei a fost dezvoltată cu DAB Kit (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SUA). Mai târziu, secțiunile au fost supuse contracolorării cu hematoxilină (Leagene, Beijing, China). În grupurile martor negative, s-a utilizat tampon PBS în locul anticorpilor primari. Imaginile au fost capturate de LEICA DM6000B cu LEICA DFC300 FX la o mărire de 400 ×. Analiza semicantitativă a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [20].

Western blot

Articulațiile gleznei au fost lizate de RIPA Lysis Buffer (Beyotime, Shanghai, China), care a implicat PMSF (Beyotime, Shanghai, China). Conform instrucțiunilor producătorului, probele de proteine ​​din tamponul RIPA au fost cuantificate cu setul de testare a proteinelor Micro BCA (Beyotime, Shanghai, China). Fiecare probă a fost utilizată pentru electroforeză cu geluri de dodecil sulfat de sodiu - poliacrilamidă 10% și apoi transferată în membranele PVDF. Membranele PVDF au fost blocate cu 3% albumină serică bovină în soluție salină tamponată Tris-Tween 20 (TBST) timp de 30 de minute la temperatura camerei. Bloturile au fost incubate cu anticorpi anti-A20, anti-P65, anti-P-P65, anti-IκBα, anti-NLRP3, anti-ASC și anti-caspază-1 la 1: 1000 peste noapte la 4 ° C și cu ridiche de cal anticorp secundar conjugat cu peroxidază (Abcam, Cambridge, Marea Britanie) timp de 60 de minute la temperatura camerei. Bloturile au fost scanate și analizate cu software-ul Image J.

analize statistice

Toate datele au fost analizate utilizând software-ul GraphPad Prism 6 și au fost exprimate ca medie ± deviație standard (SD) utilizând un singur sens ANOVA. Diferența cu valoarea P

Rezultate

PZH a ameliorat simptomele șoarecilor CIA

Pentru a investiga efectul PZH asupra artritei, diferite doze de PZH au fost administrate oral șoarecilor CIA timp de 4 săptămâni consecutive și MTX a fost utilizat ca control pozitiv. Eritemul și umflarea labelor posterioare la șoarecii CIA au putut fi observate în mod semnificativ, în timp ce tratamentul cu PZH a ameliorat simptomele artritei, a inhibat umflarea și eritemul labelor posterioare la șoarecii CIA (Fig. 1a). În mod consecvent, scorurile artritei la șoarecii CIA tratați cu PZH au fost semnificativ mai mici decât cele din grupul model (Fig. 1b). Evaluarea histologică a articulațiilor gleznei a relevat infiltrarea celulelor inflamatorii, hiperplazia sinovială și distrugerea articulațiilor în grupul model. În timp ce tratamentul cu PZH ar putea atenua aceste modificări histopatologice (Fig. 1c, d).

pien

PZH a scăzut producția de citokine în ser și articulații de șoareci CIA

Pentru a evalua efectul antiinflamator al PZH, s-au utilizat analiza ELISA și imunohistochimia pentru a detecta nivelurile de citokine proinflamatorii din ser și, respectiv, sinoviu. Datele au indicat faptul că nivelurile de IL-1β, IL-6 și IL-17 în ser (Fig. 2a - c) și sinovium (Fig. 3a - c) de șoareci CIA au fost semnificativ crescute în grupul model comparativ cu cele normale în grupul tratat cu PZH comparativ cu grupul model.

PZH a inhibat calea semnalului NF-κB în articulațiile șoarecilor CIA

Deoarece rezultatele de mai sus au arătat că PZH-M a avut un efect mai bun asupra șoarecilor CIA, am ales apoi PZH-M pentru un studiu ulterior al mecanismului. Am detectat mai întâi expresia P65, P-P65 și IκBα în articulațiile gleznei șoarecilor prin Western Blot. Așa cum se arată în FIG. 4, nivelul P-P65 a fost semnificativ crescut în grupul model comparativ cu grupul normal și a scăzut în grupul tratat cu PZH în comparație cu grupul model. Prin contrast, nivelul IκBα a scăzut în grupul model comparativ cu grupul normal și a crescut în grupul tratat cu PZH în comparație cu grupul model. În plus, nivelul P65 nu a avut nicio diferență semnificativă în toate grupurile.

PZH a suprimat inflammasomul NLRP3 în articulațiile șoarecilor CIA

Pentru a investiga mecanismul antiinflamator al PZH la șoarecii CIA, expresia NLRP3, ASC și caspaza-1 activată (caspaza-1 P20) în articulațiile gleznei șoarecilor au fost detectate prin Western blot. Rezultatele au arătat că nivelurile de NLRP3, ASC și caspază-1 P20 au fost semnificativ crescute în grupul model comparativ cu grupul normal, în timp ce tratamentul cu PZH a scăzut nivelurile acestor factori în comparație cu grupul model (Fig. 5).

PZH a crescut producția de proteină A20 în articulațiile șoarecilor CIA

Pentru a investiga în continuare dacă mecanismul antiinflamator al PZH a fost relativ la expresia A20, Western blot și analiza imunohistochimiei au fost utilizate pentru a detecta nivelul de proteine ​​din articulațiile gleznei și, respectiv, sinoviul șoarecilor. Așa cum se arată în FIG. 6, în grupul model, nivelul A20 a scăzut semnificativ în comparație cu grupul normal. Tratamentul cu PZH a crescut semnificativ producția de A20 în comparație cu grupul de modele.

PZH nu a avut o toxicitate semnificativă la șoarecii CIA

Pentru a investiga dacă PZH a avut toxicitate la șoareci CIA, au fost detectate nivelurile de ALT și AST pentru hepatotoxicitate, precum și CREA și UREA pentru nefrotoxicitate. Așa cum se arată în FIG. 7, tratamentul cu PZH nu a modificat semnificativ nivelurile de ALT, AST, CREA și UREA.

PZH nu a avut o toxicitate semnificativă la șoarecii CIA. Nivelurile de ALT A, AST b, CREA c și UREA d în serul șoarecilor au fost prezentate respectiv. n = 6 fiecare grup

Discuţie

PZH este un medicament antiinflamator brevetat chinezesc, având efect terapeutic asupra hepatitei, colecistitei și a altor boli. Recent, sa raportat că PZH ameliorează unele boli inflamatorii autoimune, cum ar fi scleroza multiplă [11]. Cu toate acestea, dacă PZH ar putea fi utilizat pentru a trata RA a fost încă incert. În acest studiu, am imunizat șoareci DBA/1J cu colagen bovin tip II pentru a induce un model CIA și am tratat acești șoareci CIA cu doze diferite de PZH. Am constatat că PZH ar putea ameliora semnificativ eritemul și umflarea labelor posterioare și ar putea îmbunătăți condițiile patologice în articulațiile gleznei șoarecilor CIA. Infiltrarea celulelor inflamatorii, inflamația sinovială și afectarea articulațiilor la șoareci CIA au fost ameliorate după tratamentul cu PZH. Aceste rezultate implicau că PZH ar putea fi utilizat pentru a trata RA. Simultan, determinarea biochimică a sângelui a indicat faptul că PZH nu a prezentat insuficiență funcțională semnificativă a ficatului și a rinichilor.

Principalul fenomen patologic al RA a fost sinovita. Inflamația pe termen lung a sinoviului ar accelera leziunea și, în cele din urmă, ar agrava disfuncțiile și malformațiile articulare. Sinovita a fost cauzată de răspunsuri inflamatorii persistente, care au fost cauzate de numărul crescut de celule inflamatorii și secreția crescută a diferiților mediatori inflamatori, cum ar fi IL-1β, IL-6 și IL-17. Aceste citokine ar putea face celulele T, celulele B, celulele mononucleare și neutrofilele să se adune în articulațiile bolnave și să producă proliferarea și fibroza sinovocitelor, să stimuleze sinovocitele să producă mai mulți factori de stimulare a coloniilor, chimiocine, factori proinflamatori și alți mediatori inflamatori pentru a amplifica răspunsul inflamator [ 21,22,23]. În prezent, unii inhibitori ai factorilor inflamatori au fost utilizați clinic pentru tratarea RA, inclusiv tocilizumab, inhibitor al IL-6 și anakinra, inhibitor al IL-1β [24, 25]. În acest studiu, am detectat nivelurile de IL-1β, IL-6, IL-17 în ser și sinoviu pentru a observa efectul PZH asupra șoarecilor CIA. Am constatat că PZH ar putea inhiba expresia factorilor pro-inflamatori IL-1β, IL-6 și IL-17 la șoareci CIA, care reflectă, de asemenea, efectul terapeutic al PZH asupra șoarecilor CIA.

Citokinele inflamatorii exprimate într-o varietate de celule și reglate prin căi de semnalizare, care au jucat roluri importante în medierea răspunsurilor imune și inflamatorii în RA [26]. Cele mai clasice căi de transducție a semnalului în RA au inclus calea semnalului NF-κB [27, 28]. Stimularea semnalelor inflamatorii a determinat activarea continuă a căii NF-κB, urmată de proteina inhibitoare IκBα degradată, rezultând eliberarea P65 [29]. După fosforilare, moleculele active P-P65 s-au legat de regiunile promotor ale diferitelor gene, provocând expresii anormale ale factorilor inflamatori din aval, inclusiv IL-1β, IL-6 și IL-17 [30]. Studiile anterioare au raportat că componenta eficientă a PZH, ginsenozida Rf, Rd, Rh2 și notoginsenozida R1 ar putea regla activitatea căii de semnal NF-κB [31,32,33,34]. Rezultatele noastre experimentale au arătat că PZH ar putea inhiba activitatea căii de semnal NF-κB în țesutul gleznei șoarecilor CIA, ceea ce a implicat că efectul antiinflamator al PZH ar putea fi legat de reglarea căii de semnal NF-κB.

În acest studiu, a fost evaluată eficacitatea PZH pe șoareci CIA și a fost studiată reglarea PZH pe calea de semnalizare NF-κB și inflammasomul NLRP3. Cu toate acestea, cercetarea privind efectul și mecanismul conex al PZH asupra distrugerii osoase la șoareci CIA a lipsit în acest studiu, deși ameliorarea distrugerii osoase a fost găsită prin analize histologice. În plus, studiile anterioare au indicat faptul că A20 ar putea atenua, de asemenea, leziunile osoase la șoarecii CIA [44]. Prin urmare, ne vom concentra asupra A20 și calea semnalului aferent pentru a investiga în continuare efectul PZH asupra distrugerii osoase la șoarecii CIA.

Concluzie

În concluzie, acest studiu a explorat preliminar efectul și posibilul mecanism de acțiune al PZH asupra șoarecilor CIA. Rezultatele au arătat că PZH a efectuat un efect terapeutic bun asupra șoarecilor CIA, iar mecanismul ar putea fi legat de reglarea căii de semnalizare NF-κB și a inflammasomului NLRP3.