CUM posedă site-uri acceptate de fosfo-acceptori MAPK/ERK și domenii de andocare.

plos

A. O schemă a domeniilor de proteine ​​CUM (L). Sunt indicate locațiile siturilor TP la pozițiile 59 și 64, acidul glutamic la poziția 106 necesar pentru homodimerizare și cele patru locuri potențiale de andocare MAPK/ERK. Domeniul STAR/GSG este indicat de pătrate colorate: domeniul QUA1 (albastru deschis), domeniul maxi-KH (galben) și domeniul QUA2 (verde). De asemenea, este indicată zona bogată în tirozină din capătul C-terminal (roz). B. Alinierea secvențelor de aminoacizi HOW (L) din 12 specii de Drosophila. În timp ce T64 este conservat în toate speciile, T59 este conservat doar în cinci dintre ele (reziduurile conservate sunt delimitate de cadre negre). E106 este, de asemenea, pe deplin conservat, la fel ca site-urile de andocare presupuse (nu sunt prezentate). C. Alinierea proteinei HOW (L) cu proteinele de mamifer QKI-5 și Sam68 și omologii nematodici, GLD-1 și ASD-2. Domeniul Qua1 este subliniat în albastru deschis, domeniul maxi-KH în galben și Qua2 în verde. Rețineți site-urile TP conservate, E106 și diverse site-uri de andocare, delimitate de cadre. Atât domeniul DEF cât și al doilea domeniu D (la aa 121) sunt conservate în proteinele mamiferelor QKI și Sam68, în timp ce primul (la aa 85) și al treilea (la aa 245) domeniile D sunt conservate în proteinele C. elegans (acesta din urmă este conservat și în QKI).

Figura 2.

CUM (L) este fosforilat in vitro și în celule S2R + de către MAPK/ERK pe unul sau mai multe site-uri TP.

Figura 3.

CUM (L) fosforilarea se corelează cu homo-dimerizarea sa.

Figura 4.

CUM fosforilarea își întărește afinitatea față de ARN, fără a-i afecta localizarea subcelulară.

A. Test de legare in vitro a ARN-proteine. Construcțiile HOW (L) WT, HOW (L) TTAA sau HOW (L) EG marcate cu HA au fost purificate din celule S2R + prin imunoprecipitare a etichetei HA, urmată de eluare cu peptidă HA liberă. CUM (L) celulele transfectate WT au fost fie tratate cu U0126, fie nu au fost tratate. Volumele egale de proteine ​​purificate au fost incubate cu oligomeri de 12 nt marcați cu biotină care fie se leagă CUM (panoul superior), fie nu se leagă CUM (panoul mediu). Complexele au fost incubate cu bile de avidină, eluate prin fierbere în tampon de probă și au reacționat cu anti HOW într-un Western blot. Cantitățile de proteine ​​HOW utilizate pentru fiecare reacție au fost comparabile (panoul de jos). B - C ′. Localizarea HOW (L) nu a fost modificată din cauza mutațiilor din reziduurile Thr. Celulele care exprimă fie CUM (L) WT (B, B ′), fie CUM (L) TTAA (C, C ′) au fost colorate pentru CUM (roșu, B - C). Imaginile de îmbinare (B ′ - C ′) prezintă, de asemenea, GFP (verde, marchează celulele transfectate) și Lamin (albastru).

Figura 5.

CUM fosforilat este detectat în nucleele mușchilor somatici și cardioblastelor.

Figura 6.

CUM reglează nivelurile de ARN Sls și proteine ​​într-o manieră dependentă de fosforilare.

Figura 7.

Drosophila MAPK rolled direcționează CUM fosforilarea în mușchi și reglarea nivelurilor de Sallimus.

A. CUM a fost imunoprecipitat din lizatele larvelor de a treia etapă, fie exprimând ARN-uri rulate în mușchii de sub mef2-GAL4 (stânga), fie de heterozigoți mef2-GAL4 de tip sălbatic (w−, dreapta) și au reacționat cu un anticorp pTP pentru a-i observa fosforilarea nivel și cu anti-HOW pentru a compara nivelurile HOW totale. Extractul brut a reacționat cu anti-HOW și anti-Tubulin ca un control de încărcare, arătând că cantitatea totală de HOW nu este modificată semnificativ de nivelurile MAPK/laminate. Rețineți reducerea fosforilării HOW după expresia ARN-ului laminat. B. Reducerea nivelurilor MAPK/laminate ridică nivelul proteinelor Sls. Aceleași genotipuri ca în A au fost analizate de Western cu următorii anticorpi (de sus în jos): anti-Sls, anti-MHC, anti-MSP300, anti-pERK (pentru a verifica reducerea MAPK activat în aceste larve) și anti- α-Actinina ca control al încărcării. C - H. Larvele de tip ARNi (F - H) laminate de tip sălbatic (C - E) și mef2-GAL4> au fost colorate cu anticorp anti-Sls (roșu, C, F) și anti MSP-300 (albastru, D, G). Îmbinarea este afișată în E, H. Rețineți înălțimea semnificativă a nivelurilor Sls după reglarea descendentă a nivelurilor MAPK/Rolled.

  • Publicații
  • PLOS Biology
  • Medicina PLOS
  • PLOS Computational Biology
  • PLOS Genetica
  • Agenți patogeni PLOS
  • PLUS UNU
  • Boli tropicale neglijate PLOS

PLOS este o corporație nonprofit 501 (c) (3), # C2354500, cu sediul în San Francisco, California, SUA