A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Elena Dozio, Alexis Elias Malavazos

solubile

Departamentul de Afiliere pentru Științe Biomedice pentru Sănătate, Catedra de Patologie Clinică, Universitatea din Milano, Milano, Italia

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Elena Dozio, Alexis Elias Malavazos

Unitatea de diabetologie și boli metabolice de afiliere, I.R.C.C.S. Policlinico San Donato, San Donato Milanese, Milano, Italia

Departamentul de Afiliere pentru Științe Biomedice pentru Sănătate, Catedra de Patologie Clinică, Universitatea din Milano, Milano, Italia

Unitatea de diabetologie și boli metabolice de afiliere, I.R.C.C.S. Policlinico San Donato, San Donato Milanese, Milano, Italia

Adresa actuală: Institutul de Anatomie Moleculară și Celulară, Universitatea din Regensburg, Regensburg, Germania

Departamentul de Afiliere pentru Științe Biomedice pentru Sănătate, Catedra de Patologie Clinică, Universitatea din Milano, Milano, Italia

Unitatea de Cardiologie de Afiliere, I.R.C.C.S. Policlinico San Donato, San Donato Milanese, Milano, Italia

Unitatea de Chirurgie Cardiacă de Afiliere, I.R.C.C.S. Policlinico San Donato, San Donato Milanese, Milano, Italia

Unitatea de Chirurgie Cardiacă de Afiliere, I.R.C.C.S. Policlinico San Donato, San Donato Milanese, Milano, Italia

Unitatea de Chirurgie Cardiacă de Afiliere, I.R.C.C.S. Policlinico San Donato, San Donato Milanese, Milano, Italia

Institutul de afiliere pentru chimie clinică și medicină de laborator, Universitatea din Regensburg, Regensburg, Germania

Institutul de afiliere pentru chimie clinică și medicină de laborator, Universitatea din Regensburg, Regensburg, Germania

Departamentul de Științe Biomedice pentru Sănătate, Catedra de Patologie Clinică, Università degli Studi di Milano, Milano, Italia, Serviciul de Medicină de Laborator 1-Patologie Clinică, Departamentul de Servicii de Sănătate de Diagnostic și Tratament-Medicină de Laborator, I.R.C.C.S. Policlinico San Donato, San Donato Milanese, Milano, Italia

  • Elena Dozio,
  • Alexis Elias Malavazos,
  • Elena Vianello,
  • Silvia Briganti,
  • Giada Dogliotti,
  • Francesco Bandera,
  • Francesca Giacomazzi,
  • Serenella Castelvecchio,
  • Lorenzo Menicanti,
  • Alexander Sigrüener

Cifre

Abstract

Citare: Dozio E, Malavazos AE, Vianello E, Briganti S, Dogliotti G, Bandera F și colab. (2014) Interleukin-15 și Solubil Interleukin-15 Receptor α la pacienții cu boli coronariene: asociere cu grăsimi epicardice și indicii de distribuție a țesutului adipos. PLOS ONE 9 (3): e90960. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0090960

Editor: Raffaella Bonecchi, Universitatea din Milano, Italia

Primit: 11 octombrie 2013; Admis: 5 februarie 2014; Publicat: 6 martie 2014

Finanțarea: Studiul a fost susținut de fonduri de la Ministerul Sănătății din Italia „Ricerca Corrente” I.R.C.C.S. Policlinico San Donato, fonduri interne de la Universitatea din Regensburg și proiectul-cadru al UE „LipidomicNet”. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Interleukina-15 (IL-15) este o citokină pro-inflamatorie de 14-15 kDa cu capacitatea de a induce proliferarea celulelor T, de a spori citotoxicitatea celulelor T și a celulelor ucigașe naturale, de a proteja celulele T și neutrofilele de apoptoză și de a stimula secreția de citokine pro-inflamatorii [1]. Semnalele IL-15 prin intermediul unui receptor de membrană trimeric compus din lanțul alfa specific IL-15R (IL-15Rα), lanțul IL-2R/IL15Rβ și lanțul comun γ [2]. Lanțul IL-15Rα poate exista în mai multe izoforme generate de îmbinarea alternativă sau prin scindarea proteolitică a formei membranei și joacă, de asemenea, un rol important în transportul IL-15 în afara celulelor [3] - [6]. Pe lângă faptul că este un receptor legat de membrană, IL-15Rα este și o moleculă secretată capabilă să exercite atât funcții superagoniste, cât și antagoniste [5], [7].

Studiile anterioare au indicat faptul că IL-15 este exprimat de celule inflamatorii situate la plăci aterosclerotice vulnerabile [8], iar concentrația serică de IL-15 este semnificativ mai mare la pacienții cu boală coronariană (CAD) sau boală arterială periferică decât persoanele sănătoase [9], [ 10]. Mai mult, variantele genetice IL-15 și IL-15Rα au fost legate de un risc crescut de CAD [10], [11].

Relația dintre obezitate, inflamație și CAD a fost sugerată de diferite studii, iar dovezile cumulative s-au concentrat, de asemenea, pe asocierea dintre țesutul adipos visceral și riscul crescut de CAD [12] - [14]. Mai recent, o mare atenție a fost acordată țesutului adipos epicardic (EAT), un țesut adipos visceral metabolic activ care înconjoară și se infiltrează în miocard și în vasele mari. Datorită apropierii anatomice strânse de inimă și absenței granițelor fasciale, EAT poate interacționa local cu miocardul și arterele coronare prin secreția paracrină a adipokinelor proinflamatorii și pro-aterogene, sugerând astfel că o cantitate excesivă de EAT poate reprezenta o leziuni inflamatorii dăunătoare țesutului cardiovascular și ar putea juca, de asemenea, un rol activ în relația dintre adipozitate, inflamație și boli cardiovasculare, în principal CAD [15] - [17].

Deoarece implicarea potențială a IL-15 în patogeneza și progresia CAD a fost sugerată anterior, dar, după cunoștințele noastre, niciunul dintre aceste studii nu a concentrat atenția asupra contribuției țesutului adipos și distribuției sale la CAD, în studiul de față am urmărit: - să evalueze nivelurile plasmatice de IL-15 și IL-15Rα solubil al acestuia la pacienții afectați sau nu de CAD; - să studieze relațiile IL-15 și IL-15Rα cu indicele de masă corporală (IMC) și indicii de distribuție a țesutului adipos [circumferința taliei (WC), raportul talie la șold (WHR) și grosimea EAT]; - să evalueze dacă EAT ar putea fi, de asemenea, o sursă potențială de IL-15 și IL-15Rα.

Materiale și metode

Declarație de etică

Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică local (ASL Milano Due, n. 2516), iar pacienții și-au dat consimțământul informat în scris asupra protocolului de examinare, efectuat în conformitate cu Declarația de la Helsinki, revizuită în 2000.

Populația de studiu

Un total de 82 de pacienți supuși unei intervenții chirurgicale pe cord deschis la I.R.C.C.S. Au fost înscriși Policlinico San Donato (San Donato Milanese, Milano, Italia). Conform examenului angiografic coronarian preoperator, 63 au fost pacienți cu CAD supuși grefei de bypass a arterei coronare (CABG) și 19 au fost pacienți non-CAD care au necesitat o intervenție chirurgicală pe cord deschis pentru înlocuirea valvei (VR).

Au fost excluși pacienții cu infarct miocardic recent, boală malignă, intervenție chirurgicală abdominală majoră anterioară, insuficiență renală, insuficiență cardiacă în stadiul final și variație de peste 3% a greutății corporale în ultimele 3 luni. Pacienții au fost măsurați pentru înălțimea, greutatea, talia și circumferințele șoldului; s-au calculat indicele de masă corporală (IMC) și raportul talie/șold (WHR).

Colectarea sângelui

Probele de sânge au fost colectate după un post peste noapte în tuburi fără pirogeni cu acid etilendiaminetetraacetic ca anticoagulant. Probele de plasmă au fost separate după centrifugare la 1000 g timp de 15 minute și au fost depozitate la -20 ° C până la analiză. Glucoza de post, insulina, colesterolul total și HDL, trigliceridele și alți parametri biochimici au fost analizați în I.R.C.C.S. Laboratorul central Policlinico San Donato, după cum sa raportat anterior [18], [19]. LDL-colesterolul a fost calculat cu formula Friedewald. Evaluarea modelului de homeostazie a rezistenței la insulină (HOMA-IR) a fost calculată utilizând următoarea ecuație: HOMA-IR = insulină de post [µU/mL] × glucoză de post [mmol/L] /22,5.

Colecția EAT

Probele de biopsie EAT au fost recoltate adiacente arterei coronare drepte proximale înainte de inițierea pompării by-pass cardiopulmonare. Probele au fost depozitate în reactivul de țesut Allprotect (Qiagen, Hilden, Germania) la -20 ° C până la extracția ARN.

Cuantificarea depozitului EAT

Toți pacienții au fost examinați prin ecocardiografie utilizând un VSF color-Doppler în modul M (Vingmed-System Five; General Electric, Horten, Norvegia) cu o sondă cu traductor de 2,5 - 3,5 MHz. Grosimea EAT a fost măsurată pe peretele liber al ventriculului drept, atât din vederi parasternale cu axa lungă, cât și cu axa scurtă și apare ca un spațiu neomogen fără ecou, ​​așa cum sa raportat anterior [20]. Am ales să măsurăm grosimea EAT pe ventriculul drept din două motive: (1) acest punct este recunoscut ca fiind cea mai mare grosime absolută a EAT [21] și (2) viziunile parasternale cu axa lungă și scurtă permit măsurarea cea mai precisă a EAT pe ventriculul drept cu orientarea optimă a fasciculului cursorului în fiecare vedere [20].

Imunoanalize

Nivelul plasmatic al IL-15 și IL-15Rα a fost testat prin teste imunosorbente legate de enzime conform procedurii producătorului (R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA pentru IL-15 și Wuhan EIAab Science, Wuhan, China pentru IL-15Rα).

Extracția ARN și analiza expresiei genei

ARN-ul total a fost extras din țesut cu ajutorul kitului de țesut lipidic RNeasy conform procedurii producătorului (Qiagen, Hilden, Germania). Concentrația de ARN a fost cuantificată de NanoDrop 2000 (ThermoScientific, Wilmington, Germania) și integritatea ARN a fost evaluată utilizând kitul Agilent RNA 6000 Nano și Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Analiza expresiei genei a fost realizată de o platformă de microarray cu o singură culoare (Agilent). 50 ng de ARN total au fost etichetate cu Cy3 folosind culoarea Agilent LowInput Quick-Amp Labeling Kit-1 color, conform instrucțiunilor producătorului. ARNc a fost purificat cu RNeasy Mini Kit (Qiagen) și cantitatea și eficiența etichetării au fost măsurate cu NanoDrop. Hibridizarea a fost efectuată cu kitul de hibridizare Agilent Gene Expression, scanarea a fost făcută cu sistemul de scanare Agilent G2565CA Microarray și datele au fost procesate cu software-ul Agilent Feature Extraction (10.7) și software-ul ChipInspector (Genomatix, München, Germania). 75 de sonde selectate sunt reproduse de 10 ori pentru a permite măsurarea reproductibilității în interiorul matricei.

Analize statistice

Datele au fost analizate utilizând pachetul statistic biochimic GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) și Statistix 7.0 (Analytical Software, Tallahassee, FL). Valorile tuturor măsurătorilor au fost exprimate ca medie ± SD și atunci când sunt indicate și prin interval, număr și procent. Normalitatea distribuției datelor a fost evaluată prin testul Kolmogorov-Smirnoff. Comparația între grupuri a fost efectuată utilizând testul Student t cu două cozi nepereche sau testul U Mann-Whitney, după caz. Testul χ 2 a fost utilizat pentru variabilele categorice. O analiză de regresie multiplă a fost utilizată pentru a testa asocierea independentă a indicilor de distribuție a grăsimilor (IMC, circumferința taliei, grosimea EAT și WHR) cu nivelurile de IL-15 și IL-15Rα (variabile dependente). O valoare p Tabelul 1. Caracteristicile demografice și antropometrice ale pacienților cu CABG și VR.

IL-15 Nivel circulant

Cuantificarea proteinelor IL-15 circulante a indicat faptul că pacienții cu CABG au avut un nivel IL-15 mai mare decât pacienții cu VR (4,19 ± 0,53 pg/ml față de 2,48 ± 0,24 pg/ml, p = 0,01, Figura 1).

Creșterea nivelului circulant al interleukinei-15 (IL-15) a fost observată în chirurgia de altoire a bypass-ului coronarian (CABG) comparativ cu pacienții cu înlocuire a valvei (VR). Datele sunt medii ± SD. * p = 0,01.

După clasificarea pacienților în funcție de IMC în grupurile cu greutate normală (NW) și grupuri supraponderale/obeze (OB), am observat creșterea nivelului IL-15 numai la pacienții cu OB CABG (4,60 ± 0,67 pg/ml) comparativ cu ambii cu NW CABG (2,54 ± 0,22 pg/mL, p = 0,01) și la pacienții cu OB VR (2,47 ± 0,27 pg/mL, p = 0,01) (Figura 2A). Nu s-a observat nici o diferență nici între pacienții cu VR VR și OB VR (2,50 ± 0,56 pg/ml pentru VR VR față de 2,47 ± 0,27 pg/ml de la VR VR, p = 0,93) și nici între pacienții NW CABG și VR VR (2,54 ± 0,22 pg/mL pentru CABG vs. 2,50 ± 0,56 pg/mL pentru VR, p = 0,71) (Figura 2A).

A) Nivelul interleukinei-15 (IL-15) în pacienții cu chirurgie de altoire a bypass-ului arterelor coronare (CABG) și înlocuirea valvei (VR) clasificați, în funcție de indicele de masă corporală, în grupuri cu greutate normală (NW) și grupe cu obezitate excesivă (OB). Datele sunt medii ± SD; * p = 0,01. B) Nivelul IL-15 la pacienții cu CABG și VR clasificat, în funcție de circumferința taliei, valoarea tăiată de ≥102 cm. Datele sunt medii ± SD; * p Figura 3. Nivelul plasmatic al receptorului interleukinei-15 α (IL-15Rα) la pacienții cu intervenție chirurgicală de altoire a arterei coronare (CABG) și înlocuirea valvei (VR).

Creșterea nivelului circulant al receptorului interleukinei-15 α (IL-15Rα) a fost observată în chirurgia de altoire a bypass-ului arterelor coronare (CABG) comparativ cu pacienții cu înlocuire a valvei (VR). Datele sunt medii ± SD. * p 0,05 pentru ambele) (Figura 4A). S-a observat o diferență semnificativă statistic între VR NW (1 * 10 −3 ± 1 * 10 −4 pg/mL) și pacienții cu OB VR (1,23 ± 0,60 pg/mL, p −3 ± 1 * 10 −4 pg/mL ) și NW CABG (2,30 ± 0,78 pg/ml p Figura 4. Influența adipozității și a grosimii EAT asupra nivelului plasmatic al receptorului interleukin-15.

A) Nivelul α al receptorului interleukinei-15 (IL-15Rα) la pacienții cu chirurgie de altoire a bypass-ului arterial coronarian (CABG) și înlocuirea valvei (VR) clasificați, în funcție de indicele de masă corporală, în greutate normală (NW) și supraponderali-obezi (OB) grupuri. Datele sunt medii ± SD. * p 0,05 pentru ambele) (Figura 4B). S-a observat o diferență semnificativă statistic între cele două grupuri VR (1 * 10 −3 ± 1 * 10 −4 pg/mL pentru VR −3 ± 1 * 10 −4 pg/mL pentru VR −3 ± 1,8 * 10 −3 pg/mL, p −3 ± 1,8 * 10 −3 pg/mL vs 0,37 ± 0,62 pg/mL, respectiv, p = 0,30) și nici între grupurile VR și CABG cu WHR ≥0,95 (2,54 ± 0,93 pg/mL vs. 4,02 ± 1,36 pg/ml, respectiv, p = 0,37) (Figura 4C).

Nivelul IL-15Rα a fost, de asemenea, evaluat după clasificarea pacientului în funcție de valoarea mediană a grosimii EAT ecocardiografice (8 mm atât pentru grupurile CABG, cât și pentru grupurile VR) [19]. Deși se poate observa o tendință de creștere între pacienții cu VR cu grosimea EAT 0,05 pentru toți). (Figura 4D).

Corelează IL-15 și IL-15Rα

Relațiile independente ale IMC și indicii de distribuție a țesutului adipos (circumferința taliei, grosimea WHR și EAT) cu nivelurile plasmatice de IL-15 și IL-15Rα la pacienții cu CAD au fost evaluate prin analize de regresie multiple. WHR a fost cel mai bun corelat atât al IL-15 (r 2 = 0,40, p 2 = 0,39, p Figura 5. Studiul expresiei genei în depozitul de țesut adipos epicardic.

A) Cuantificarea nivelului de mARN al interleukinei-15 (IL-15) în probele de țesut adipos epicardic (EAT) obținute de la pacienții supuși unei intervenții chirurgicale de altoire a by-passului coronarian (CABG) sau de înlocuire a valvei (VR). Datele sunt medii ± SD. * p Figura 6. Influența indicilor de distribuție a țesutului adipos asupra grosimii EAT.