AFILIATII
AFILIATII
AFILIATII
AFILIATII
AFILIATII
AFILIATII
AFILIATII

Autor corespondent (Adresă):

Articol asociat la Pubmed, Google Scholar

pozitivă

Leucocitele neutrofile polimorfonucleare (PMN) sunt celule cu imunitate înnăscută recunoscute într-un frotiu de sânge periferic din cauza nucleului lor multilobular particular. Nucleii în formă de inel sunt tipici la șobolani și șoareci, fiind descriși în unele patologii la om, precum și la subiecți sănătoși. Aceste neutrofile au fost găsite precoce la pacienții cu boala Chagas. Aici, acest studiu a fost realizat pentru a observa comportamentul și caracteristicile morfologice ale PMN ale culturii autologe și, pe de altă parte, distribuția sa sexuală la indivizi sănătoși (H) și cu serologie Chagas pozitivă (CH).

Materiale și metode: Cuantificarea celulelor inelare în frotiuri de probe de sânge uman heparinizat cu și fără serologie pozitivă pentru Chagas; testarea cu reacție citochimică pentru tehnica mieloperoxidazei (MPO); culturi de celule autologe; Test LPS pentru generarea de NET-uri, ADN vizualizat cu DAPI în microscopie de imunofluorescență; studiu ultrastructural cu microscopie electronică de transmisie (TEM).

Rezultate: Nu s-au găsit diferențe semnificative în frotiurile de sânge în numărul de neutrofile cu nuclee inelare între sexe în ambele grupuri (H și CH). Diferențe semnificative (p Introducere

Recent s-a raportat că neutrofilele participă la un rol cheie în mecanismele efectoare și de reglare ale răspunsurilor înnăscute și adaptative [1-3]. Neutrofilele se mai numesc polimorfonucleare (PMN) deoarece nucleul lor poate avea trei până la cinci lobi conectați prin punți subțiri de cromatină. S-a propus că compoziția proteică a anvelopei nucleare a neutrofilelor le permite „deformabilitatea” nucleului său și ar facilita migrarea celulelor activate din vase către locurile de infecție și, de asemenea, lobulația și formele din inel [4,5] . Existența PMN murin cu nucleu în formă de inel a fost cunoscută de mult timp, dar la neutrofilele umane nucleul inelar a fost observat mai devreme de Cabral în 1987 la pacienții chagasici și la persoanele sănătoase [6,7]. Nucleii în formă de inel din neutrofile erau compuse din trei sau patru zone lobate complet conectate între ele, unele dintre ele printr-o bandă subțire de ADN. S-a propus că numărul mare (aproximativ 15%) al acestor celule din sângele periferic sugerează că acestea pot fi un stadiu evolutiv normal în dezvoltarea PMN uman [6,7]. Mai mult, în unele patologii, cum ar fi mononucleoza infecțioasă, sindroamele mielodisplazice și altele, s-au observat nuclee în formă de inel și la neutrofilele umane [8-15].

PMN recunosc microorganismele prin diverși receptori și recunoașterea promovează fagocitoza și apoi distrugerea citotoxică [16]. Granulele au un conținut bogat foarte divers și un set de peptide degradative microbiostatice sau microbicide precum mieloperoxidaza (MPO) din granulele azuropile [17]. În condiții inflamatorii, PMN captează și ucid microbii prin capcane extracelulare (NET) compuse din proteine ​​din cromatină, histonă și granule [18-21]. NET-urile au fost propuse ca punți pentru unirea răspunsurilor imune înnăscute și adaptive prin reducerea pragului de activare a celulelor T [22]. De asemenea, a descris generarea de NET cu stimuli inflamatori sterili din cristale de urat monosodic [23]. NET-urile au fost, de asemenea, implicate în tromboză, leziuni tisulare și autoimunitate [24-26]. Eliberarea NET-urilor poate fi „NEToză litică suicidă” atunci când derivă moartea PMN sau „NEToză vitală” în cazul PMN-urilor care sunt încă în viață [25,26]. Nu se găsește în literatura de specialitate care raportează formarea de NET în neutrofile cu nuclee în formă de inel.

Au fost descrise neutrofile care eliberează chemokine care atrag celulele T către locurile de inflamație și [27-29] citokine care influențează diferențierea și proliferarea crescând-o în unele cazuri și suprimând-o în altele [30,31]. Citokinele IL17A și IL17F secretate de celulele Th 17 induc o infiltrare rapidă și masivă a țesutului afectat de neutrofile [16]. În cazul infecțiilor parazitare, cum ar fi boala Chagas, rolul citokinelor familiale IL 17 este un domeniu de cercetare curentă [32].

Aici, acest studiu a fost realizat pentru a observa comportamentul și caracteristicile morfologice ale PMN ale culturii autologe și, pe de altă parte, distribuția sa sexuală la indivizi sănătoși (H) și cu serologie Chagas pozitivă (CH).

Probele de sânge uman heparinizat au fost colectate cu consimțământul etic conform procedurilor aprobate de comitetul de etică al Spitalului Național Clinicas R: 107/12, Minute Book I, Nº 110, 12/04/12. Eșantioane donate de Banca de Sânge, Institutul de Hematologie și Hemoterapie al Universității Naționale din Cordoba în anonimat, cu serologie negativă: Hudleson (Wiener), VDRL (Wiener), Chagas HAI (Wiener) Chagas EIE (Biomerieux), HBs EIE (Biomerieux) ), HBc (Biomerieux), HCV EIE (Murex), HIV Ac EIE (Biomerieux), HIV Ag EIE (Biomerieux), HTLV EIE (Murex). Persoanele considerate „sănătoase” (H) n = 30, 22 bărbați și 8 femele, cu vârsta cuprinsă între 20 și 63 de ani; și numai cei cu serologie pozitivă pentru Chagas (CH) n = 10 HAI (+) și EIE (+), 6 bărbați și 4 femele, interval de vârstă: 37-50.

Am efectuat frotii extinse sau de sânge integral, în toate cazurile și în probe de culturi autologe. Frotiurile au fost fixate în alcool etilic 96º, colorare de 15 minute: hematoxilină/eozină (H/E). Neutrofilele cu nucleul inelar au fost vizualizate prin microscopie optică și procentul de celule inelare într-o citopreparare dată a fost calculat numărând 100 de neutrofile. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± deviație standard.

Datele au fost prezentate ca valoare medie ± SD, testul Student t a fost aplicat pentru analiza datelor *** p Reacție citochimică pentru mieloperoxidază (MPO)

Frotiurile proaspete de sânge au fost uscate la aer timp de 5 minute. Se acoperă extins cu următoarea soluție: benzidină (0,07 g) în nitroprusidă de sodiu soluție apoasă mai saturată (0,25 mL) peste etanol 96º (24,8 mL). A fost permis să acționeze timp de 5 minute. Fără a răsturna soluția de mai sus, s-a adăugat apă distilată (20 vol) 0,1%. Apoi a fost amestecat suflând prin pipetă pentru omogenizarea ambelor soluții și lăsat să stea timp de 2 minute. A fost spălat cu uscare distilată.

Culturi totale de celule leucocitare din sânge circulant, suspendate în baloane de sticlă conice sterile, 37 ° C în mediu TC199 (SIGMA, St. Louis, MO) adăugate cu ser filtrat de la același donator. O placă de cultură celulară cu 24 de godeuri a fost preparată prin punerea unui capac de sticlă rotund de 13 mm, strecurat în fiecare godeu pentru a efectua testul de formare NETs și apoi observații în microscopul de imunofluorescență. Controlul viabilității celulare a fost efectuat prin testul de excludere clasic cu colorantul Trypan Blue 0,5%. Probele au fost prelevate în momente diferite: 1, 2, 3, 20, 24, 48 și 72 de ore de cultură. Probele au fost fixate în alcool etilic 96º timp de 15 minute și colorate cu H/E pentru observare la microscopul optic. Unele probe au fost prelucrate pentru microscopie electronică de transmisie (TEM).

Celulele cultivate într-o placă de cultură celulară cu 24 de godeuri au fost stimulate la formarea NET-urilor cu LPS (Sigma-Aldrich) [43] 25 ng/ml la 37 ° C într-un incubator de CO2. Mostre: 30 min. Lamele de acoperire din sticlă cu celule atașate au fost îndepărtate cu atenție de pe placa de cultură. Au fost spălate scurt în PBS (soluție salină tamponată cu fosfat), fixarea a fost efectuată cu paraformaldehidă 4% timp de 10 minute și spălate în trei modificări în PBS. Colorare ADN cu DAPI (4,6'-diamidino-2-fenilindol, Sigma, St Louis, MO). Mediu de montare glicerol 90% în PBS. Observarea preparatelor în microscopul de imunofluorescență, videomicroscop Axioscop 20, MC80, trinocular, Carl Zeiss. Probele de sânge pereche au furnizat controale.

Peletele celulare au fost preparate cu probe cu alicote de culturi cultivate. Au fost fixați în glutaraldehidă 1% în tampon cacodilat 0,1 M timp de o oră și fixați în OsO4 1% în același tampon timp de o oră. Apoi, materialele au fost deshidratate în acetonă de gradare crescândă și încorporate în rășină epoxidică (Araldite) la 60 o C timp de 24-48 de ore. Mai târziu, secțiunile ultra subțiri 60 au fost realizate la 80 nm grosime (interferență de culoare argintiu/auriu) care au fost colectate pe rețele de cupru de 250 de bare pe inch, contrastate cu acetat de uranil și citrat de plumb și studiate cu microscopul electronic Zeiss LEO-906E transmisie.

Prezența neutrofilelor cu nucleu în formă de inel a fost pozitivă atât în ​​frotiurile de sânge circulante de H, cât și de CH (Figura 1). În toate probele din H s-a observat prezența celulelor inelare, cu un interval de la 3 la 15%, în medie: 7,90; SD: 2,77. Dintre femele s-a găsit un interval de celule inelare de la 3 la 15%, în medie: 8,87; SD: 3,52 și la bărbați un interval de celule inelare de 5-13%, medie: 7,54; SD: 2,44. A fost efectuat testul Student t pentru probe mici și nu s-a găsit nicio diferență semnificativă de celule inelare între femei și bărbați sănătoși. În toate probele de CH s-a observat prezența neutrofilelor cu nucleu inelar, cu un interval de 10-18%, medie: 14,30; SD: 2,00. La femele, s-au găsit celule inelare cuprinse între 10 și 15%, medie: 13,25; SD: 2,21. La masculi un interval de celule inelare de 13-18%, medie: 15; SD: 1,67. Nu s-au găsit diferențe semnificative de celule inelare între sexe la pacienții cu CH. S-au găsit diferențe semnificative de celule inelare în comparația persoanelor sănătoase și serologie pozitivă pentru Chagas (*** p Rezultate observate cu tehnica mieloperoxidazei (MPO) în celulele inelare

Este de remarcat faptul că granulele MPO pozitive ale neutrofilelor sunt vizibile și abundente în cantitate, acoperind aproape tot citoplasma în culoare negru maroniu. Prezența acestei enzime în celulele inelare ale H, precum și în cele ale donatorilor de CH este extrem de pozitivă comparabilă cu cea observată la neutrofilele polilobulate din ambele grupuri (Figura 2).

În probe la 2 ore de culturi de leucocite autologe s-a observat prezența neutrofilelor cu nucleu în formă de inel în H și CH (Figura 2).

Celulele cultivate au fost stimulate la formarea NET-urilor cu LPS și au fost observate în microscopul de imunofluorescență. În toate testele de stimulare cu LPS la 30 de minute NET-uri generate vizualizate ca distribuție a cromatinei în numeroase fibrile sau colorare difuză albastră a DAPI (ADN) (Figura 2). Am observat formarea NET în celulele inelare în cultura pacientului CH fără stimulare LPS (Figura 2).

Neutrofilele apoptotice prezintă condensarea nucleului, marginarea cromatinei și uneori corpurile apoptotice (Figura 3).

În H, după 3 ore de cultură am observat unele neutrofile cu caracteristici apoptotice, pe de altă parte, la 20 de ore majoritatea neutrofilelor erau în apoptoză (Figura 3).

În CH, la 48 de ore de cultură autologă, am observat o imagine NEToză, membranele nucleare erau complet fragmentate în timp ce majoritatea granulelor erau dizolvate, permițând contactul direct și amestecarea componentelor nucleare, citoplasmatice și granulare (Figura 4). După 72 de ore de cultură autologă, au persistat neutrofile viabile cu nucleu polilobulat (Figura 4).

Acest studiu a fost realizat pentru a observa comportamentul și caracteristicile morfologice ale PMN ale culturii autologe și, pe de altă parte, distribuția sa sexuală la indivizi sănătoși (H) și cu serologie pozitivă Chagas (CH). În prezent, puțin se găsește în literatura de specialitate despre neutrofile cu nucleu în formă de inel, deoarece acestea sunt slab descrise în unele boli și la omul sănătos puține referințe fac referire [3-15]. În acest studiu, ne-am concentrat pe găsirea neutrofilelor cu nucleu în formă de inel în sângele periferic al oamenilor sănătoși și a celor cu serologie pozitivă pentru Chagas; pentru a nu doar să le observe prezența, ci să evidențieze aspecte ale morfologiei și citochimiei lor. A fost propusă și posibilitatea de a le găsi în culturi autologe de leucocite totale din sângele periferic.

Colaborăm cu Banca de Sânge a Universității Naționale din Cordoba, Argentina, astfel încât majoritatea donatorilor sunt persoane sănătoase sau asimptomatice care își donează sângele în mod voluntar. Au avut loc doar câteva cazuri de serologie pozitivă a lui Chagas și au fost informați de Banca Sângelui în acel moment. Nu mai avem date de tratament ulterior. Așa că am lucrat cu un eșantion mic cu serologie pozitivă pentru Chagas. Majoritatea acestor persoane provin din interiorul provinciei Córdoba. Nu s-au găsit diferențe semnificative în frotiurile de sânge în numărul de neutrofile cu nucleu în formă de inel între sexe în ambele grupuri. Diferențe semnificative (p Concluzie

Studiul comportamentului și caracteristicilor morfologice ale PMN la pacienții sănătoși și cu serologie pozitivă pentru Chagas ne-a permis să concluzionăm: a) numărul crescut de celule inelare și pozitivitate ridicată la MPO în CH; b) formarea ET-urilor în celulele inelare în cultura pacienților cu CH fără stimulare LPS; c) longevitate crescută a PMN polilobulat în CH. După 72 de ore de cultură autologă, neutrofilele viabile cu nucleu polilobulat au persistat la pacienții cu serologie pozitivă pentru Chagas. Ce stimuli contribuie la creșterea duratei medii de viață în cultura PMN din Chagas? Acest lucru ar fi legat de prezența citokinelor și a mediatorilor inflamatori în serul donatorilor. Estimăm că studiile viitoare pentru a determina profilul fenotipic al acestor neutrofile vor fi extrem de interesante.

Pentru Banca de Sânge a Institutului de Hematologie și Hemoterapie, Universitatea Națională din Cordoba, Cordoba, Argentina pentru donarea de sânge. Mulțumim profesorului Ana M. Granata pentru editarea în limba a lucrării. De asemenea, suntem recunoscători recenzenților ale căror comentarii ne-au ajutat să aducem modificări manuscrisului nostru.