Orsolya M. Palacios

1 USDA/ARS Centrul de Cercetare în Nutriție pentru Copii, Departamentul de Pediatrie, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX 77030, SUA

fizice

7 Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare

Juan J. Carmona

2 Institutul Medical Howard Hughes și Laboratoarele Paul F. Glenn pentru Mecanismele Biologice ale Îmbătrânirii, Departamentul de Patologie, Școala Medicală Harvard, Boston, MA 02115, SUA

3 Massachusetts General Hospital Cancer Center, Charlestown, MA 02129, SUA

4 Departamentul Societății, Dezvoltarea Umană și Sănătate, Școala Harvard de Sănătate Publică, Boston, MA 02115, SUA

7 Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare

Shaday Michan

5 Paul F. Glenn Laboratoarele pentru mecanismele biologice ale îmbătrânirii, Departamentul de patologie, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, SUA

Ke Yun Chen

1 USDA/ARS Centrul de Cercetare în Nutriție pentru Copii, Departamentul de Pediatrie, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX 77030, SUA

Yasuko Manabe

6 Joslin Diabetes Center & Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, SUA

Jack Lee Ward III

1 USDA/ARS Centrul de Cercetare în Nutriție pentru Copii, Departamentul de Pediatrie, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX 77030, SUA

Laurie J. Goodyear

6 Joslin Diabetes Center & Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, SUA

Qiang Tong

1 USDA/ARS Centrul de Cercetare în Nutriție pentru Copii, Departamentul de Pediatrie, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, TX 77030, SUA

Date asociate

Abstract

SIRT3 este un membru al familiei sirtuinelor de deacetilaze dependente de NAD +, care este localizată în mitocondrii și este îmbogățită în rinichi, țesut adipos maro, inimă și alte țesuturi active din punct de vedere metabolic. Raportăm aici că SIRT3 răspunde dinamic atât la semnalele de exercițiu, cât și la cele nutriționale din mușchiul scheletic pentru a coordona răspunsurile moleculare din aval. Arătăm că antrenamentul la exercițiu crește expresia SIRT3, precum și fosforilarea CREB asociată și reglarea ascendentă a PGC-1α. Mai mult, arătăm că SIRT3 este mai puternic exprimat în mușchiul solitar lent oxidativ de tip I comparativ cu mușchiul rapid extensor digitorum longus sau gastrocnemius. În plus, descoperim că nivelurile de proteine ​​SIRT3 din mușchii scheletici sunt sensibile la dietă, deoarece expresia SIRT3 crește prin post și restricție calorică, dar este redusă prin dieta bogată în grăsimi. Interesant este că regimul de restricție calorică duce, de asemenea, la activarea fosfo-AMPK în mușchi. În schimb, la șoarecii knockout SIRT3, descoperim că fosforilarea AMPK și CREB și expresia PGC-1α sunt reglementate în jos, sugerând că acești factori celulari cheie pot fi componente importante ale semnalelor biologice mediate de SIRT3 in vivo.

Introducere

În mușchiul scheletic, receptorul activat cu proliferatorul peroxizomului gamma coactivator-1α (PGC-1α), un co-activator al receptorului nuclear, joacă roluri multiple în reglarea metabolică [25,26]. Stimulează biogeneza mitocondrială [27], induce comutatorul de tip fibră musculară și crește capacitatea oxidativă în celulele musculare scheletice [28]. În plus față de activarea transcripțională de către CREB [29], s-a demonstrat că protein kinaza activată cu AMP (AMPK) crește, de asemenea, expresia PGC-1α [30,31] și o activează prin fosforilare directă [32]. AMPK este, de asemenea, un senzor molecular cheie și un regulator al metabolismului muscular.

AMPK este o proteină kinază serină/treonină heterotrimerică omniprezentă, care funcționează ca senzor de combustibil în multe țesuturi, inclusiv în mușchiul scheletal [33]. AMPK este activat alosteric de AMP și de fosforilare la Thr172 în subunitatea α catalitică, în principal de o kinază AMPK în amonte, LKB1 [34,35]. Important, AMPK este stimulat de stresurile celulare care diminuează ATP și cresc AMP, cum ar fi restricția dietei/hipoglicemia [36], exercițiul [37] și contracția musculară [38]. AMPK activat stimulează căile catabolice generatoare de ATP, cum ar fi absorbția celulară de glucoză și α-oxidarea acidului gras. Activarea AMPK reprimă, de asemenea, procesele consumatoare de ATP, cum ar fi lipogeneza, pentru a restabili echilibrul energetic intracelular [33,39].

Munca noastră urmărește să elucideze în continuare rolul sirtuinelor în sănătate și boală, cu accent special pe țesutul muscular în acest studiu. Raportăm aici că expresia SIRT3 în mușchiul scheletic este sensibilă la diferite semnale atât din dietă, cât și din exerciții, ducând la activarea în aval a AMPK și reglarea în sus a PGC-1α. SIRT3 este, prin urmare, un potențial regulator cheie al biologiei mușchilor scheletici, răspunzând la indicii de mediu importante și activând factorii celulari in vivo.

Rezultate

SIRT3 este reglat în mușchiul scheletic prin antrenament la exerciții

Am testat mai întâi profilul de expresie SIRT3 in vivo pentru a compara distribuția întregului corp al SIRT3, în special între mușchi și țesuturi precum adipos și rinichi, unde SIRT3 a fost descris anterior. După cum s-a prezis, modelul de distribuție tisulară SIRT3 îl reflectă pe cel al ARNm-ului SIRT3 [11]. Într-adevăr, SIRT3 prezintă o expresie ridicată în țesuturile metabolice active importante, cum ar fi rinichiul, grăsimea brună, ficatul și creierul (Figura (Figura 1). 1). La compararea expresiei între eșantioanele de mușchi, am observat că nivelurile de proteine ​​SIRT3 au fost mai mari în mușchiul soleus cu mișcare lentă, comparativ cu mușchii cu mișcare rapidă, cum ar fi extensorul digitorului lung și gastrocnemius, în acord cu un conținut mai mare de mitocondrie și caracteristica oxidativă a mușchiului soleu.

Proteina SIRT3 este exprimată abundent în țesutul adipos maro (BAT), ficat, rinichi, inimă, creier și mușchiul soleu, dar foarte scăzut în țesutul adipos alb (WAT), în mușchiul extensor digitorum lung (EDL) sau gastrocnemius mușchi (gastro). Pentru fiecare probă, 50 μg de proteine ​​au fost încărcate într-un gel de acrilamidă 10%, electroforizate și transferate într-o membrană de nitroceluloză. Membrana a fost sondată folosind un ser anti-SIRT3 sau un anticorp anti-β-actină. Bloturile au fost cuantificate cu ImageQuant și sunt furnizate rapoarte SIRT3/actină; deoarece gastrocnemius (Gastro) are cea mai scăzută expresie SIRT3 in vivo, normalizarea (l.0) a fost stabilită față de acest țesut.

Pentru a studia rolul SIRT3 în mușchi în contextul biologiei exercițiilor, am testat apoi dacă nivelurile de proteine ​​SIRT3 au fost sensibile la un protocol de exercițiu voluntar stabilit [40]. Folosind un anticorp policlonal SIRT3 anti-șoarece specific, am constatat că proteina SIRT3 a crescut selectiv în triceps, mușchiul care este antrenat în sistemul cușcă cu roți, dar nu în probele de mușchi cardiac de la aceleași animale (Figura (Figura 2A)). . Spre deosebire de SIRT3, antrenamentul de efort nu a reușit să modifice nivelurile de proteine ​​SIRT1 la triceps (datele nu sunt prezentate). Specificitatea anticorpului nostru pentru detectarea endogenului

Proteina SIRT3 de 28 kDa a fost confirmată folosind lizatele de țesut knockout SIRT3 (Figura suplimentară Figura 1). 1). În special, inducerea SIRT3 în mușchiul scheletic a fost mai mare la șoarecii femele în comparație cu cea a colegilor de sex masculin (Figura (Figura 2B). 2B). În acord cu această reglare ascendentă, am observat, de asemenea, niveluri crescute de SIRT3 în mușchiul gastrocnemius al șobolanilor exercitați pe o paradigmă de exerciții pe bază de bandă de alergare [41] (Figura suplimentară Figura 2). 2). Chiar și o săptămână de antrenament a fost suficientă pentru a crește cantitatea de proteină SIRT3 (Figura suplimentară Figura 2B). 2B). Reglarea în sus a SIRT3 (Figura (Figura2B) 2B) corelată cu fosforilarea în aval îmbunătățită a CREB la Ser133 (Figura (Figura2C) 2C) și inducția PGC-1α (Figura (Figura2D). 2D). În cele din urmă, activitatea citratului sintază, un marker mitocondrial pentru antrenamentul la exerciții, a fost semnificativ mai mare la mușchii instruiți decât la grupul de control sedentar respectiv (Figura (Figura 2E). 2E). Colectiv, aceste date sugerează că reglarea în sus a SIRT3 prin exercițiu este o consecință moleculară importantă și conservată a antrenamentului.

Aici am constatat că dieta CR a crescut semnificativ nivelurile de proteină SIRT3 în mușchiul scheletic, în comparație cu dieta de control AL (Figura (Figura3A). 3A). În plus, douăzeci și patru de ore de post au fost suficiente pentru a induce expresia musculară a SIRT3 (Figura (Figura3B). 3B). În schimb, nivelurile de proteine ​​SIRT3 au fost reduse semnificativ după trei luni de hrănire cu conținut ridicat de grăsimi cu energie (Figura (Figura3C), 3C), indicând faptul că expresia SIRT3 în mușchi fluctuează ca răspuns la absorbția nutrienților din dietă. Am măsurat apoi efectul CR asupra AMPK - o enzimă a cărei activitate este dependentă de modificările potențialului metabolic/energetic [30,31].

Pierderea SIRT3 are un impact semnificativ asupra activării expresiei AMPK, CREB și PGC-1α

Am testat apoi dacă lipsa SIRT3 ar avea impact asupra AMPK și a altor factori înrudiți, cum ar fi CREB și/sau PGC-1α în mușchiul scheletal. În concordanță cu datele noastre anterioare, am constatat că animalele SIRT3-nule au avut cu 50% niveluri mai scăzute de fosforilare AMPK în comparație cu grupul martor de tip sălbatic de control (Figura (Figura 4A). 4A). În modelul nostru de exerciții (Figura (Figura 2A-D), 2A-D), reglarea în sus a SIRT3 a îmbunătățit activarea în aval a CREB și PGC-1α. În consecință, la șoarecii SIRT3-nul, activarea fosforilării CREB la Ser122 a fost, de asemenea, redusă (Figura (Figura 4B), 4B), care s-a corelat cu activarea transcripțională redusă a pgc-1α (Figura (Figura 4C). 4C). Acest rezultat este în concordanță cu datele publicate anterior, care arată că atât AMPK, cât și CREB activează expresia pgc-1α in vivo [29].

Colectiv, datele noastre susțin un model de lucru în care SIRT3 răspunde dinamic la diferite semnale nutriționale și fiziologice pentru a avea un impact potențial asupra homeostaziei energiei musculare prin AMPK și PGC-1α. Deoarece AMPK poate fosforila și activa CREB [52], SIRT3 poate activa CREB direct sau prin AMPK. Având în vedere rolul său dinamic, acțiunea SIRT3 în interiorul celulelor musculare scheletice poate servi ca o țintă importantă de diagnostic și terapeutic pentru impactul asupra sănătății și bolilor umane.

Având în vedere studiul nostru, va fi interesant să testăm dacă animalele SIRT3-null prezintă defecte în anumite provocări de mediu. În ciuda hiper-acetilării proteinelor mitocondriale la șoarecii knockout SIRT3, semnificația acestor modificări biochimice este neclară. Un studiu recent al șoarecilor cu deficit de SIRT3 de către un alt grup nu a găsit defecte în metabolismul bazal și nici termogeneza adaptativă, în timp ce șoarecii erau găzduiți în condiții dietetice/sedentare standard [13]. În mod similar, am găsit o performanță normală a benzii de rulare la șoarecii knockout SIRT3 în timp ce se aflau sub carcasă standard (observații nepublicate). Cu toate acestea, la provocarea cu diferite semnale de mediu, aceste animale pot răspunde diferit. În consecință, testăm activ modul în care provocările provocate de CR/post/dietă bogată în grăsimi și exerciții fizice pot afecta șoarecii SIRT3-nul și pot modifica factorii celulari cheie din aval din celulele musculare.

Interesant, s-a arătat, de asemenea, că activarea AMPK, la restricția nutrienților de glucoză a celulelor stem musculare, determină o creștere a raportului celular NAD +/NADH, în concordanță cu o buclă de feedback pozitivă necesară pentru activarea SIRT1 prelungită [48], precum poate apar în modelul nostru SIRT3 și merită testarea. Într-adevăr, un al doilea studiu in vitro validează independent un model similar NAD +/NADH prin AMPK [49]. În mod surprinzător, activarea AMPK (așa cum se întâmplă cu CR) poate duce, de asemenea, la extinderea duratei de viață [50-52], iar viitorul studiu va arăta dacă SIRT3 este implicat în acest proces. Se știe că AMPK activat fosforilează direct PGC-1α [32] și CREB [53] - și că atât AMPK cât și CREB sunt implicate în transactivarea PGC-1a [54,55]. În cele din urmă, atât SIRT3, cât și SIRT1 promovează biogeneza mitocondrială și oxidarea acizilor grași prin PGC-1α, dar în moduri diferite. SIRT3 promovează expresia PGC-1α în timp ce SIRT1 activează PGC-1α prin deacetilare directă [56]. Cu toate acestea, am constatat că antrenamentul de exercițiu reglementează SIRT3, dar nu și expresia SIRT1 în mușchi. În prezent, rămâne de luat în considerare modul în care aceste două enzime sirtuin cheie pot funcționa în mod cooperativ în interiorul anumitor țesuturi ca răspuns la semnalele de mediu.

Astfel, va fi interesant să se testeze dacă șoarecii SIRT3-nul inductibili ai țesuturilor prezintă defecte metabolice globale din exercițiile fizice și/sau regimurile de dietă în diferite părți ale corpului, în special odată cu îmbătrânirea. Această abordare genetică inductibilă ne va permite, de asemenea, să ocolim potențialele efecte compensatorii rezultate din lipsa SIRT3 în timpul dezvoltării. În plus, un model de șoarece cu supraexpresie crescută SIRT3 în mușchi (și/sau alte țesuturi specifice) va fi, de asemenea, un instrument valoros pentru elucidarea în continuare a rolului (rolurilor) biologice ale acestei sirtuine in vivo. Toate aceste lucrări vor fi importante, deoarece luptăm împotriva îmbătrânirii și a tulburărilor asociate, de la diabetul de tip 2 (și alte boli metabolice) la cancerul de sân, în care expresia SIRT3 este aberantă. Prin urmare, activatorii cu molecule mici ale SIRT3, în curs de dezvoltare și testare [62], pot oferi căi terapeutice noi și cheie pentru tratamentul unei varietăți de boli comune, probabil prin imitarea efectelor moleculare benefice ale exercițiului fizic și/sau restricției calorice în vivo.

Proceduri experimentale

Sirt3 -soareci knockout. Șoarecii în care gena Sirt3 (Aderare:> NM_022433) a fost vizată de captarea genei au fost obținute de la Texas Institute for Genomic Medicine (Houston, TX, SUA). Pe scurt, acești șoareci au fost creați prin generarea de celule stem embrionare (ES) (Omnibank Nr. OST341297) cu o capcană promotor retroviral care inactivează funcțional o alelă a genei Sirt3, așa cum a fost descris anterior [63]. Analiza secvenței a indicat faptul că inserția retrovirală a avut loc în intronul care precede exonul 2 de codificare (Figura suplimentară Figura 1). 1). Celulele stem embrionare 129/SvEvBrd vizate au fost injectate în blastocisti albini C57BL/6. Chimerele (129/SvEvBrd) au fost apoi încrucișate cu albinoși C57BL/6 pentru a produce heterozigoții. Heterozigoții au fost apoi împerecheați și descendenții au fost genotipați utilizând PCR, conținând doi grani care flancează situl de inserare a casetei de captare TG0003-5 '(ATCTCGCAGATAGGCTATCAGC) și TG0003-3' (AACCACGTAACCTTACCCAAGG), precum și un al treilea exemplu invers LTR situat la 5 ' capătul casetei de captare (ATAAACCCTCTTGCAG TTGCATC). Perechea de grund TG0003-5 'și TG0003-3' amplifică un fragment de 336bp din alela de tip sălbatic, în timp ce perechea de grund TG0003-5 'și LTR rev amplifică un fragment de 160bp din alela knockout.

Anticorpi și Western blots. Anticorpii utilizați pentru analiza Western blot au inclus: ser SIRT3 anti-șoarece crescut împotriva capătului C-terminal (DLMQRERGKLD GQDR, Genemed Synthesis, Inc.) și utilizat pentru distribuția țesuturilor și analize ale dietei bogate în grăsimi; serul SIRT3 anti-șoareci și anti-șobolani a fost, de asemenea, dezvoltat împotriva regiunilor C-terminale ale fiecărei proteine ​​respective (Covance), iar serul anti-șoarece a fost validat pentru specificitate utilizând grăsime brună, țesut cardiac și mușchi soleu de la șoareci knockout SIRT3 (Fig. Suplimentar 1), apoi utilizat pentru analiza probelor de exerciții. Alți anticorpi utilizați au inclus următoarele: anti-fosfo-CREB/Ser133 (Cell Signaling); anti-CREB (semnalizare celulară); anti-fosfo-AMPK (semnalizare celulară); AMPK (Semnalizare celulară); anti-PGC-1α (Calbiochem); anticorp β-actină (Santa Cruz); și α-tubulină (Abcam).

Cifre suplimentare

Figura 1 suplimentară

(A) Structura genică Sirt3 adnotată [62, 52], care prezintă site-ul de inserție retrovirală pentru inactivarea SIRT3 la șoarecii nuli. Liniile indică poziția relativă a codonilor de start ATG cunoscuți; codonul de oprire, TAA, este indicat în exonul 7 (E7). Nomenclatura pentru denumirile de exoni prezentate aici este preluată de la Cooper și colab. [52]. (B) Nivelurile de proteine ​​SIRT3 au fost testate din țesuturile șoarecilor cu deficit de genă Sirt3 omozigotă sau heterozigotă, utilizând analiza Western blot standard (ca înainte).

Figura 2 suplimentară

(A) Panouri reprezentative Western blot de probe de mușchi de șoareci utilizate pentru cuantificare în Figura Figura 2, 2 și (B) mușchi de șobolan care arată că reglarea în sus a SIRT3 are loc încă de la o săptămână pe o paradigmă de exerciții bazată pe banda de alergare stabilită anterior [52]. În mod remarcabil, dimensiunea moleculară a proteinelor SIRT3 de la șoarece și șobolan este păstrată.

Mulțumiri

Mulțumim Dr. E. O'Brian Smith pentru asistență în analiza statistică, Dr. Martin Young pentru discuții/sugestii valoroase și Margaret Nguyen pentru asistență tehnică. O.M.P. a fost sprijinit de o subvenție de formare a Institutelor Naționale de Sănătate (NIH) (T32> HD007445) și J.J.C. de o bursă predoctorală Howard Hughes Medical Institute. L.J.G. a primit sprijin din partea unui grant NIH (RO1DK068626). Această lucrare a fost susținută și de subvenții acordate Q. T. din S.U.A. Departamentul Agriculturii (CRIS 6250-51000-049) și NIH (RO1DK075978).

Note de subsol

Autorii acestui articol nu raportează niciun conflict de interese.