Limin Zhang

a Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, SUA

b Laborator cheie CAS de rezonanță magnetică în sisteme biologice, Laborator cheie de stat de rezonanță magnetică și fizică atomică și moleculară, Centrul național de rezonanță magnetică din Wuhan, Institutul de fizică și matematică Wuhan, Academia chineză de științe, Wuhan, China

Cen Xie

c Laborator de metabolizare, Institutul Național al Cancerului, Institutele Naționale de Sănătate, Bethesda, Maryland, SUA

Robert G. Nichols

a Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, SUA

Siu H. J. Chan

d Departamentul de Inginerie Chimică, Universitatea de Stat din Pennsylvania, University Park, Pennsylvania, SUA

Changtao Jiang

Departamentul de fiziologie și fiziopatologie, Școala de științe medicale de bază, Universitatea din Beijing și Laboratorul cheie de științe cardiovasculare moleculare, Ministerul Educației, Beijing, China

Ruixin Hao

a Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, SUA

Philip B. Smith

f Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, SUA

Jingwei Cai

a Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, SUA

Margaret N. Simons

d Departamentul de Inginerie Chimică, Universitatea de Stat din Pennsylvania, University Park, Pennsylvania, SUA

Emmanuel Hatzakis

g Departamentul de Chimie, Universitatea de Stat din Pennsylvania, University Park, Pennsylvania, SUA

h Departamentul de Știință și Tehnologie Alimentară, Universitatea de Stat din Ohio, Columbus, Ohio, SUA

Costas D. Maranas

d Departamentul de Inginerie Chimică, Universitatea de Stat din Pennsylvania, University Park, Pennsylvania, SUA

Frank J. Gonzalez

c Laborator de metabolizare, Institutul Național al Cancerului, Institutele Naționale de Sănătate, Bethesda, Maryland, SUA

Andrew D. Patterson

a Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, SUA

Date asociate

Grafic cu bare al scorului LDA pentru speciile bacteriene care sunt mai abundente la șoarecii tratați cu vehicul și Gly-MCA (A), șoarecii tratați cu vehicul față de grupul de tratament Gly-MCA plus GW4064 (B) și Gly-MCA- șoareci tratați față de cei tratați cu Gly-MCA plus GW4064 (C). Descărcați Figura S1, fișier TIF, 1,4 MB.

Spectre reprezentative 1H RMN de 600 MHz pentru extracte apoase de ficat din vehicul (A), șoareci tratați cu Gly-MCA (B), vehicul Fxr fl/fl (C) și șoareci Fxr fl/fl tratați Gly-MCA). Regiunea δ 5,1 până la 9,20 în spectrul hepatic a fost extinsă vertical de 8 ori comparativ cu regiunea δ 0,6 până la 4,4. Chei: 1, lipidă; 2, izoleucina; 3, leucina; 4, valină; 5, d -3-hidroxibutirat; 6, lactat; 7, alanină; 8, acetat; 9, lizină; 10, glutamat; 11, glutamina; 12, glutation; 13, succinat; 14, piruvat; 15, aspartat; 16, colină; 17, fosforilcolina; 18, glicerofosfocolina; 19, TMAO; 20, taurină; 21, glucoză și aminoacizi; 22, trigliceride; 23, a-glucoză; β-glucoză; 24, glicogen; 25, acid gras nesaturat; 26, uridină; 27, UDP (UDP); 28, inozină; 29, AMP (AMP); 30, fumarat; 31, tirozină; 32, histidină; 33, fenilalanină; 34, uracil; 35, xantină; 36, UMP (UMP); 37, hipoxantină; 38, nicotinamidă; 39, betaină; 40, acizi biliari; 41, inozin-5'-monofosfat (5'-IMP); 42, format; 43, adenozină. Vezi și Tabelul S2. Descărcați Figura S2, fișier TIF, 0,9 MB.

Scorurile O-PLS-DA (stânga) și graficele de încărcare codificate cu coeficient de corelație pentru modelele (dreapta) din datele RMN ale extractelor apoase de ficat, discriminând între șoarecii tratați cu Gly-MCA și șoarecii de tip sălbatic (WT) tratați cu vehicul (A) sau șoareci tratați cu Gly-MCA și șoareci din grupul de tratament Gly-MCA plus GW4064 (B). Descărcați Figura S3, fișier TIF, 1,4 MB.

Scorurile O-PLS-DA (stânga) și graficele de încărcare codificate cu coeficient de corelație pentru modelele (dreapta) din datele RMN ale extractelor apoase de ficat, discriminând între șoarecii Fxr fl/fl tratați cu vehicul și șoarecii Fxr fl/fl tratați cu Gly-MCA (A), șoareci tratați cu vehicul Fxr ΔIE și șoareci tratați cu vehicul Fxr fl/fl (B), șoareci tratați cu vehicul Fxr ΔIE și tratați cu Gly-MCA șoareci Fxr ΔIE (C) și șoareci tratați Gly-MCA Fxr ΔIE și Șoareci Fxr fl/fl tratați cu Gly-MCA (D). Descărcați Figura S4, fișier TIF, 1,8 MB.

Scorurile O-PLS-DA (stânga) și graficele de încărcare codificate cu coeficient de corelație pentru modelele (dreapta) din datele RMN ale extraselor de conținut cecal apos discriminând între grupul tratat cu Gly-MCA și șoarecii tratați cu vehicul de tip sălbatic (WT) (A) sau grupul tratat cu Gly-MCA versus grupul tratat cu Gly-MCA plus GW4064 (B). Descărcați Figura S5, fișier TIF, 0,9 MB.

Gly-MCA reduce nivelurile de ARNm legate de metabolismul lipidelor, acidului gras, trigliceridelor și acidului biliar în obezitatea indusă de HFD prin inhibarea activității FXR. Analiza nivelurilor de ARNm ale Srebp1c, Cidea, Acaca, Fasn, Elovl5 și Elovl6 în condiții de agonism/antagonism chimic la șoareci de tip sălbatic (A) sau agonism la șoareci de tip sălbatic sau la șoareci Fxr ΔIE (B). Analiza nivelurilor de ARNm de Dgat1, Dgat2, Hmgcr și Hmgcs1 sunt prezentate în panourile C și F. Analiza nivelurilor de ARNm de Cyp7a1, Cyp7b1, Cyp8b1 și Cyp27a1 în ficatul șoarecilor tratați cu vehicul, șoarecilor tratați cu Gly-MCA, și șoareci tratați cu Gly-MCA au administrat GW4064 (A, B și C) sau în șoareci Fxr fl/fl și Fxr ΔIE cu sau fără tratament Gly-MCA (D, E și F). Datele sunt prezentate ca medii ± SD (n = 5 per grup). *, P Acest conținut este distribuit în condițiile licenței Creative Commons Attribution 4.0 International.

Gly-MCA reduce nivelurile de ARNm legate de metabolismul lipidic și inflamația în obezitatea indusă de HFD prin inhibarea activității FXR. Sunt prezentate rezultatele analizei nivelurilor de ARNm de Srebp1c, Cidea, Lcn2, IL-1β, Tnf-α și Saa1 în țesutul adipos al șoarecilor Fxr fl/fl alimentați cu HFD cu și fără tratament Gly-MCA și HFD Șoareci Fxr ΔIE cu și fără tratament Gly-MCA. Datele sunt mijloace ± SD (n = 5 per grup); *, P Acest conținut este distribuit în condițiile licenței Creative Commons Attribution 4.0 International.

Exemple de secvențe pentru qRT-PCR. Descărcați tabelul S1, fișier DOCX, 0,02 MB.

1 H RMN modificări chimice pentru metaboliții atribuiți în extracte de ficat. Descărcați tabelul S2, fișier DOCX, 0,03 MB.

Cele 10 specii reprezentative utilizate în modelul metabolic comunitar al microbiomului intestinal (format din 10 specii reprezentative cu reconstrucții publicate la scară genomică). Descărcați tabelul S3, fișier DOCX, 0,02 MB.

ABSTRACT

IMPORTANŢĂ Receptorul X farnesoid (FXR) joacă un rol important în medierea dialogului dintre gazdă și microbiota intestinală, în special prin modularea circulației enterohepatice a acizilor biliari. Dovezile sugerează că ablația genetică a Fxr în intestin sau antagonismul chimic cu restricție intestinală a FXR promovează efecte benefice asupra sănătății, inclusiv prevenirea bolilor hepatice grase nealcoolice la modelele de rozătoare. Cu toate acestea, întrebările rămân fără răspuns, inclusiv dacă modularea activității FXR joacă un rol în modelarea structurii și funcției comunității microbiotei intestinale și ce căi metabolice ale microbiotei intestinale contribuie într-o manieră dependentă de FXR la fenotipul gazdei. În acest raport, noi cunoștințe sunt obținute despre contribuția metabolică a microbiotei intestinale la fenotipurile metabolice, inclusiv stabilirea unei legături între antagonismul FXR, activitatea bacteriană a hidrolazei sării biliare și fermentația. Pentru a confirma aceste rezultate au fost folosite abordări multiple, inclusiv modele unice de șoarece, precum și metabolomică și modele metabolice la scară genomică.

INTRODUCERE

Prevalența crescută a obezității și a tulburărilor metabolice asociate acesteia continuă să fie o problemă majoră de sănătate la nivel mondial, din cauza mai multor factori, inclusiv genetica, stilul de viață, expunerea chimică la mediu și dieta (1, –3). Obezitatea este considerată un factor de risc major pentru bolile cronice, cum ar fi diabetul zaharat de tip 2, ateroscleroza și cancerul (4, 5). Din perspectiva metabolismului, obezitatea este rezultatul unui dezechilibru între consumul de energie și consumul de energie, ducând astfel la depozitarea excesivă a grăsimilor în ficat și țesutul adipos și, ulterior, poate promova multiple tulburări metabolice (6, 7).

În studiul actual, o combinație de secvențierea genei 16S rRNA, metabolomică bazată pe rezonanță magnetică nucleară 1 H (RMN) și modele metabolice la scară genomică a fost utilizată pentru a investiga modificarea microbiotei intestinale și a metabolomului gazdă la șoarecii alimentați cu HFD tratați Gly-MCA. Șoarecii specifici intestinului Fxr-nul (Fxr ΔIE) hrăniți cu HFD au fost de asemenea angajați pentru a investiga mecanismul prin care inhibarea semnalizării FXR îmbunătățește tulburările metabolice legate de obezitate. În plus, corelația dintre microbiomul intestinal și metabolomul gazdei în condiții tratate cu Gly-MCA a fost analizată cu scopul de a identifica o axă specifică de semnalizare a microbiotei gazdă care contribuie la tulburări metabolice, inclusiv obezitatea și NAFLD. Acest studiu oferă noi dovezi că Gly-MCA are efecte benefice asupra obezității prin modularea microbiotei intestinale și inhibarea semnalizării FXR intestinale.

REZULTATE

Gly-MCA modulează compoziția microbiotei intestinale și căile funcționale conexe.

receptorului

Rezultatele analizei PICRUSt ale căilor funcționale prezise în microbiota intestinală. Căile sunt grupate pe baza următoarelor categorii: metabolismul aminoacizilor (albastru), metabolismul carbohidraților și lipidelor (galben) și metabolismul energetic (verde). Valorile abundenței căii pentru control (roșu) și tratamentul Gly-MCA (verde închis) sunt reprezentative pentru cantitatea de gene și normalizate la numărul total de gene prezente într-o cale particulară din fiecare probă. Aceste căi au fost, de asemenea, ordonate prin scăderea acoperirii, care a fost calculată pe baza cantității totale posibile de gene (conform bazei de date Metacyc). Căile funcționale prevăzute subliniate au fost susținute de analize metabolomice ale extractelor hepatice. Toate căile prezentate sunt semnificative conform LEfSe. LEfSe folosește testul Kruskal-Wallis și testul Wilcoxon la o limită de 0,05 pentru a determina căi semnificative și relevante biologic între două grupuri.

Rezultatele analizei metabolomicii RMN pentru profilarea metabolică a ficatului de șoarece. (A) Scorul tridimensional al scorului PCA de la metabolomii hepatici ai șoarecilor tratați cu vehicul, șoarecii tratați cu Gly-MCA și șoarecii tratați cu Gly-MCA cărora li s-a administrat GW4064. (B) Scorul tridimensional al scorului PCA de la metabolomii hepatici ai șoarecilor Fxr fl/fl și Fxr ΔIE cu și fără tratament Gly-MCA.

Gly-MCA reduce obezitatea prin modularea compoziției microbiotei intestinale și a semnalizării FXR intestinale.

Figura S2

Spectre reprezentative 1H RMN de 600 MHz pentru extracte apoase de ficat din vehicul (A), șoareci tratați cu Gly-MCA (B), vehicul Fxr fl/fl (C) și șoareci Fxr fl/fl tratați Gly-MCA). Regiunea δ 5,1 până la 9,20 în spectrul hepatic a fost extinsă vertical de 8 ori comparativ cu regiunea δ 0,6 până la 4,4. Chei: 1, lipidă; 2, izoleucina; 3, leucina; 4, valină; 5, d -3-hidroxibutirat; 6, lactat; 7, alanină; 8, acetat; 9, lizină; 10, glutamat; 11, glutamina; 12, glutation; 13, succinat; 14, piruvat; 15, aspartat; 16, colină; 17, fosforilcolina; 18, glicerofosfocolina; 19, TMAO; 20, taurină; 21, glucoză și aminoacizi; 22, trigliceride; 23, a-glucoză; β-glucoză; 24, glicogen; 25, acid gras nesaturat; 26, uridină; 27, UDP (UDP); 28, inozină; 29, AMP (AMP); 30, fumarat; 31, tirozină; 32, histidină; 33, fenilalanină; 34, uracil; 35, xantină; 36, UMP (UMP); 37, hipoxantină; 38, nicotinamidă; 39, betaină; 40, acizi biliari; 41, inozin-5'-monofosfat (5'-IMP); 42, format; 43, adenozină. Vezi și Tabelul S2. Descărcați Figura S2, fișier TIF, 0,9 MB.

Gly-MCA ameliorează în mod eficient tulburările metabolice legate de obezitate prin inhibarea FXR. Abundența relativă a metaboliților semnificativ modificați în ficat obținută de la șoareci tratați cu vehicul, șoareci tratați cu Gly-MCA și șoareci tratați cu Gly-MCA cărora li s-a administrat GW4064 (A); Șoareci Fxr fl/fl și Fxr ΔIE cu și fără tratament Gly-MCA (B); SCFA (acetat, butirat și propionat) și oligozaharide din conținutul de cecal de la șoareci tratați cu vehicul, șoareci tratați cu Gly-MCA și șoareci tratați cu Gly-MCA cărora li se administrează GW4064 (C). n = 5 șoareci per grup. Datele sunt mijloace ± SD (n = 5 per grup). *, Șoareci Fxr fl/fl tratați cu vehicul P fl/fl și Gly-MCA (A), șoareci tratați cu vehicul Fxr ΔIE și șoareci tratați cu vehicul Fxr fl/fl (B), tratați cu vehicul Fxr ΔIE și Gly- Șoareci tratați cu MCA Fxr ΔIE (C) și șoareci tratați cu Gly-MCA Fxr ΔIE și șoareci tratați cu Gly-MCA Fxr fl/fl (D). Descărcați Figura S4, fișier TIF, 1,8 MB.

Comparativ cu șoarecii alimentați cu HFD tratați cu vehicul, tratamentul cu Gly-MCA a scăzut semnificativ nivelurile de acizi grași cu lanț scurt (SCFA, de exemplu, acetat, propionat și n-butirat) cuplate cu niveluri ridicate de oligozaharide în conținutul cecal ( Fig. 4C; vezi și Fig. S5A în materialul suplimentar). Cu toate acestea, s-a observat o inversare semnificativă a nivelurilor de SCFA și oligozaharide în conținutul de cecal al șoarecilor alimentați cu HFD tratați cu Gly-MCA plus GW4064 (Fig. 4C; vezi și Fig. S5B). Aceste rezultate sugerează în plus că tratamentul cu Gly-MCA modulează microbiota intestinală și funcția sa de fermentare asociată.

Figura S5

Scorurile O-PLS-DA (stânga) și graficele de încărcare codificate cu coeficient de corelație pentru modelele (dreapta) din datele RMN ale extraselor de conținut cecal apos discriminând între grupul tratat cu Gly-MCA și șoarecii tratați cu vehicul de tip sălbatic (WT) (A) sau grupul tratat cu Gly-MCA versus grupul tratat cu Gly-MCA plus GW4064 (B). Descărcați Figura S5, fișier TIF, 0,9 MB.

Figura S6

Relația dintre microbiomul intestinal și metabolomul gazdei. O analiză de corelație Pearson a fost utilizată pentru a investiga relațiile dintre populațiile bacteriene și nivelurile de metabolit după tratamentul cu Gly-MCA (cu și fără GW4064). Semnificația statistică a fost determinată prin transformarea valorii Pearson r în valoarea t și apoi folosind distribuția t pentru a găsi valoarea P. Valorile de corelație peste 0,63 sau sub -0,63 au fost semnificative statistic. Hărți de căldură ale corelației dintre microbiota intestinală și metaboliții de la șoareci tratați cu Gly-MCA (A și B) și șoareci tratați cu Gly-MCA și apoi tratați cu GW4064 (C și D). Rezultatele sunt prezentate pentru filele (A și C) și genurile (B și D).

DISCUŢIE

Aici, șoarecii Fxr ΔIE hrăniți cu HFD au prezentat un fenotip metabolic similar ca și șoarecii hrăniți cu Fxr ΔIE HFD tratați cu Gly-MCA. Mai mult, administrarea unui agonist FXR sintetic de înaltă afinitate, GW4064, a inversat modificările metabolice ale ficatului șoarecilor tratați cu Gly-MCA hrăniți cu HFD. Aceste observații au indicat faptul că microbiota intestinală care contribuie la îmbunătățirea obezității prin Gly-MCA necesită semnalizare FXR intestinală, care joacă un rol central în eficacitatea Gly-MCA. În mod consecvent, un studiu recent a arătat că microbiota intestinală modificată la șoarecii cu deficiență de Fxr alimentați cu HFD poate contribui direct la fenotipul obez (30). Cu toate acestea, aceste date nu pot exclude posibilitatea ca tratamentul GW4064 singur să modifice populația de microbiote intestinale ca urmare a modulației semnalizării hepatice FXR.

În concluzie, studiul de față a dezvăluit că modularea microbiotei intestinale de către Gly-MCA îmbunătățește obezitatea indusă de dietă și fenotipurile asociate prin efecte asupra profilului metabolic al lipidelor gazdă. În special, aceste căi metabolice modificate legate de obezitate s-au dovedit a fi puternic asociate cu semnalizarea FXR specifică intestinului. Aceste descoperiri au demonstrat că Gly-MCA are efecte benefice asupra obezității prin modularea microbiotei intestinale și a semnalizării FXR intestinale și ar putea fi dezvoltat ca un nou medicament pentru tratarea bolilor hepatice grase.

MATERIALE ȘI METODE

Studii pe animale.

Izolarea ARN și PCR cantitativă în timp real.

ARN-ul a fost extras din țesuturile hepatice înghețate (

50 mg) folosind reactiv TRIzol (Invitrogen). ADNc a fost sintetizat din 1 pg de ARN total utilizând qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences), iar produsele au fost diluate până la 1:10 înainte de utilizare în reacțiile ulterioare. Primeri specifici genei au fost utilizați în fiecare amestec de reacție și toate rezultatele au fost normalizate la proteina ribozomală β-actină mARN (secvențe de exemplu pot fi găsite în Tabelul S1 în materialul suplimentar). Testele cantitative PCR (QPCR) au fost efectuate folosind un amestec master SYBR QPCR verde cu un sistem ABI Prism 7900HT de detectare rapidă în timp real a secvenței PCR (Applied Biosystems). Produsele de reacție au fost analizate cu metoda ΔΔCT.

Tabelul S1

Exemple de secvențe pentru qRT-PCR. Descărcați tabelul S1, fișier DOCX, 0,02 MB.