Centrul de Cercetare a Afilierilor pentru Obstetrică, Ginecologie și Perinatologie al Ministerului Sănătății al Federației Ruse, str. Oparina 4, Moscova 117997, Rusia, Institutul de Cercetări Științifice de Morfologie Umană, Strada Tsurupa 3, Moscova 117418, Rusia, Pirogov Universitatea Națională de Cercetare Rusă din Pirogov, Ministerul Sănătății al Federației Ruse, str. Ostrovitianov 1, Moscova 117997, Rusia

studiu

Centrul de Cercetare a Afilierilor pentru Obstetrică, Ginecologie și Perinatologie al Ministerului Sănătății al Federației Ruse, str. Oparina 4, Moscova 117997, Rusia, Institutul de Cercetări Științifice de Morfologie Umană, str. Tsurupa 3, Moscova 117418, Rusia

Centrul de Cercetare a Afilierilor pentru Obstetrică, Ginecologie și Perinatologie al Ministerului Sănătății al Federației Ruse, str. Oparina 4, Moscova 117997, Rusia, Institutul de Cercetări Științifice de Morfologie Umană, Strada Tsurupa 3, Moscova 117418, Rusia, Pirogov Universitatea Națională de Cercetare Rusă din Pirogov, Ministerul Sănătății al Federației Ruse, str. Ostrovitianov 1, Moscova 117997, Rusia

Centrul de Cercetare a Afilierilor pentru Obstetrică, Ginecologie și Perinatologie al Ministerului Sănătății al Federației Ruse, str. Oparina 4, Moscova 117997, Rusia, Institutul de Cercetări Științifice de Morfologie Umană, str. Tsurupa 3, Moscova 117418, Rusia

Centrul de Cercetare a Afilierilor pentru Obstetrică, Ginecologie și Perinatologie al Ministerului Sănătății al Federației Ruse, str. Oparina 4, Moscova 117997, Rusia, Institutul de Cercetări Științifice de Morfologie Umană, str. Tsurupa 3, Moscova 117418, Rusia

Centrul de Cercetare a Afilierilor pentru Obstetrică, Ginecologie și Perinatologie al Ministerului Sănătății al Federației Ruse, str. Oparina 4, Moscova 117997, Rusia, Institutul de Cercetări Științifice de Morfologie Umană, Strada Tsurupa 3, Moscova 117418, Rusia, Pirogov Universitatea Națională de Cercetare Rusă din Pirogov, Ministerul Sănătății al Federației Ruse, str. Ostrovitianov 1, Moscova 117997, Rusia

Afiliere Institutul de Cercetări Științifice de Morfologie Umană, str. Tsurupa nr. 3, Moscova 117418, Rusia

Centrul de cercetare a afilierii de genetică medicală, str. Moskvorechie 1, Moscova 115478, Rusia

Centrul de Cercetare a Afilierii pentru Obstetrică, Ginecologie și Perinatologie al Ministerului Sănătății al Federației Ruse, str. Oparina 4, Moscova 117997, Rusia

  • Andrey Elchaninov,
  • Timur Fatkhudinov,
  • Natalia Usman,
  • Evgeniya Kananykhina,
  • Irina Arutyunyan,
  • Andrey Makarov,
  • Galina Bolshakova,
  • Dmitry Goldshtein,
  • Gennady Sukhikh

Cifre

Abstract

Citare: Elchaninov A, Fatkhudinov T, Usman N, Kananykhina E, Arutyunyan I, Makarov A și colab. (2016) Sondaj molecular privind utilizarea sursei de celule în timpul regenerării hepatice induse de hepatectomie subtotală la șobolani. PLoS ONE 11 (9): e0162613. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0162613

Editor: Matias A. Avila, Facultatea de Medicină a Universității din Navarra și Centrul de Cercetări Medicale Aplicate (CIMA), SPANIA

Primit: 17 februarie 2016; Admis: 11 august 2016; Publicat: 15 septembrie 2016

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se găsesc în lucrare.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de Fundația Rusă pentru Cercetări de Bază (http://www.rfbr.ru/rffi/eng; Acordul 14-04-01224 din 26 decembrie 2013, TF) și Grantul prezidențial rus pentru tineri oameni de știință (https://grants.extech.ru/; № 14.120.14.6239 din 3 februarie 2014, AE). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Regenerarea ficatului de mamifer a inspirat o cantitate imensă de cercetări. Majoritatea studiilor au fost efectuate pe rozătoare de laborator folosind modelul de hepatectomie parțială, adică prin excizia lobilor median și stâng, care constituie aproximativ 70% din volumul organelor [1]. În prezent, procedura este standardizată și disponibilă comercial [2], în timp ce variațiile volumului eliminat pot părea mai puțin revelatoare, atâta timp cât un număr mult mai mic de studii se ocupă de acestea [3,4].

Cu toate acestea, rezecțiile unui volum extrem de mare (80-90%) ale organului reprezintă un interes special datorită relevanței lor clinice. Gestionarea restului hepatic de dimensiuni mici rămâne încă o provocare [5], iar semnele insuficienței hepatice acute se dezvoltă frecvent în timpul transplantului de țesut hepatic, atunci când grefa este prea mică pentru a menține homeostazia. Un răspuns similar la nivel sistemic este tipic pentru pacienții ale căror ficat au fost supuși unei rezecții extinse care au părăsit o parte extrem de mică a organului, pentru a împiedica răspândirea unei tumori [5,6].

O serie de gene cu expresie diferențială au fost legate de anumite puncte critice ale regenerării ficatului; lista include citokine (Il1b, Il6, Il10), factori de creștere (Hgf, Tgfb, Fgf2, Tnfa) [7,8,9] și alte molecule de reglare. În special, descrierile modelului de expresie pentru o anumită moleculă pot diferi în detalii. De exemplu, unii dintre autori au descoperit că expresia genelor Il1b, Il6, Il10, Hgf, Tgfb și Fgf2 rămâne ridicată 2-3 zile după rezecția subtotală [10,11,12], în timp ce alții o descriu ca serie de izbucniri scurte sau ca un singur vârf [6].

Obiectivul studiului actual a cuprins o caracterizare actualizată a regenerării ficatului din resturi mici în termeni de expresie genică, împreună cu evaluarea contribuțiilor hepatocitelor și HPC.

Materiale și metode

Model experimental

Condiția limită produsă de hepatectomia subtotală de 80% la un șobolan este descrisă ca o insuficiență hepatică acută. Condiția este rezolvată în decursul a 48 de ore fie prin moartea spontană a animalului, fie prin trecerea la recuperarea rapidă (fig. S1) și nu au fost raportate mijloace pentru distincția a priori între supraviețuitori și non-supraviețuitori. În ciuda îngrijorărilor cu privire la inevitabilitatea morții spontane neautorizate a anumitor părți a animalelor operate, dar luând în considerare caracterul bine stabilit, consistența și istoria continuă a modelului, Comitetul de evaluare etică de la Institutul de cercetări științifice de morfologie umană a decis să aprobă studiul (Protocolul nr. 5, 12 martie 2013). Șobolani Sprague-Dawley masculi, cu greutate corporală de 300–400 g, au fost obținuți de la Institutul pentru Chimie Bioorganică, facilități pentru animale (Pushchino, regiunea Moscovei, Rusia). Toate lucrările experimentale cu animale au fost efectuate în conformitate cu standardele de practică de laborator (Ghidurile naționale nr. 267 de către Ministerul Sănătății din Federația Rusă, 1 iunie 2003) și s-au făcut toate eforturile pentru a reduce la minimum suferința.

Deși orice studiu experimental de regenerare hepatică se potrivește în mod convențional schemei generale de lungă durată, proiectarea necesită în mod inevitabil specificații legate de sarcinile specifice ale studiului, cu provocări de bază reprezentate de alegerea rezonabilă a controlului (fie destul de intact, fie operat în mod simulat) și luarea în considerare adecvată a factorilor de confuzie care includ răspunsul la stres indus chirurgical și manifestările sistemice ale insuficienței hepatice acute, dar și interpretarea corectă a variației între animalele individuale din cadrul grupurilor și mijloacele de contabilizare a acestei variații pentru a crește fiabilitatea tratarea statistică a datelor.

Animalele au fost operate așa cum s-a descris în altă parte [2], sub anestezie generală cu dietil eter (Medhimprom, regiunea Moscovei, Rusia; 0,08 ml per litru de volum de cameră [20]), între orele 9:00 și 11:00. Dietil eterul este utilizat în mod obișnuit ca anestezic în modelarea regenerării ficatului prin hepatectomie [4,12]. În contextul nostru, a oferit cel mai puțin efect negativ asupra supraviețuirii animalelor în comparație cu alternativele sale, Zoletil ® 100 și izofluran, probabil datorită ratelor sale ridicate de clearance pulmonar (estimat la 90% din dietil eterul absorbit este expirat nemodificat) în combinație cu contribuția minimă a metabolismului hepatic la ratele de excreție a acestuia.

Pentru a accesa ficatul, s-au făcut incizii longitudinale ventrale și linii medii pe piele și peretele abdominal la nivelul organului; retractoare căptușite au fost utilizate pentru a crește vizibilitatea chirurgicală. Ficatul a fost exteriorizat, iar vasele lobilor median, laterali și superiori drepți ai ficatului au fost permanent ligate; ulterior, lobii median, stâng și superior drept au fost excizați (aproximativ 80% îndepărtarea organelor) și fixați ca probe martor pentru analiza expresiei genice (vezi mai jos). Lobii rămași, adică partea inferioară dreaptă și caudatul, menținute umede pe tot parcursul procedurii cu ser fiziologic steril, au fost readuse la poziția inițială în cavitatea abdominală, iar câmpul a fost spălat încă o dată cu ser fiziologic steril. Inciziile ventrale și dorsale au fost închise cu sutură și tratate cu 0,05% bigluconat de clorhexidină urmat de o tamponare cu alcool.

Animalele operate, câte două pe cușcă, au fost adăpostite pentru recuperare într-o cameră cu temperatură reglată, cu un ciclu lumină-întuneric de 12:12 h și acces nelimitat la alimente și apă. Sănătatea animalelor a fost inspectată de 4 ori pe zi în primele 48 de ore după operație și ulterior de 2 ori pe zi până la sacrificiu. Meloxicam (1,0 mg/kg/zi) a fost injectat în mod repetat în perna de grăsime a gâtului animalelor ca analgezie postoperatorie timp de două zile după operație; în plus, gentamicina (3,0 mg/kg/zi) a fost injectată subcutanat ca antibiotic în prima zi după operație.

Animalele au fost extrase din experiment în camera CO2 la 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 30 h, 48 h, 72 h, 5 zile, 7 zile sau 10 zile după operație (5-6 animale pentru fiecare termen); întreaga masă de țesut hepatic regenerant a fost imediat disecată și cântărită înainte de analiză.

Tot țesutul hepatic îndepărtat în timpul intervenției chirurgicale a fost colectat cu atenție și conservat pentru examinări ulterioare. În special, datele cantitative privind expresia genei pentru țesutul lobului stâng obținute prin rezecție în ziua operației au fost comparate direct cu datele corespunzătoare pentru lobul drept al aceluiași animal, recoltate la 3 ore până la 10 zile după operație; acest algoritm este recomandat pentru a minimiza variația inerentă în compararea ficatului pre și postoperator al diferitelor animale și pentru a crește puterea abordărilor statistice pentru detectarea diferențelor în expresia genelor [21]. Alternativ, țesutul hepatic de la animale neoperate sau simulate a servit drept control suplimentar în evaluarea recuperării masei hepatice și a proliferării hepatocitelor, testelor funcționale, imunocolorării și analizei Western-blot. Procedura de operație simulată a reprodus exact toate etapele intervenției chirurgicale, cu excepția faptului că lobii ficatului au fost doar scurt externizați și apoi revinți în poziția lor inițială. Grupul de control neoperat a inclus șobolani masculi intacti (n = 10) care corespund tuturor parametrilor grupului experimental.

Teste funcționale

Recuperarea funcției hepatice a fost evaluată prin concentrația serică a albuminei și testele de alanină aminotransferază (ALT). Concentrația de albumină a fost determinată prin testul fotometric Albumin DiaS® cu verde bromocrezol (DIAKON-DS, Pushchino, Rusia), iar activitatea ALT a fost măsurată prin testul fotometric GPT Dias® (DIAKON-DS), conform protocoalelor producătorului.

Microscopie cu lumină și număr de celule

Țesuturile au fost fixate în formalină 10% tamponată neutră (BioVitrum, Sankt Petersburg, Rusia), ulterior deshidratate, încorporate în parafină și secționate folosind un microtom rotativ; secțiunile de 5-7 μm au fost colorate cu hematoxilină și eozină (BioVitrum St. Petersburg, Rusia).

Proliferarea hepatocitelor a fost evaluată prin calcularea indicelui mitotic exprimat în părți la mie ((). Cifrele mitotice au fost numărate manual la 6 × 10 3 celule pentru fiecare animal.

Imunocolorarea

Anticorpii primari împotriva Sox9 sau citokeratina 19 (CK19; Abcam, Cambridge, Marea Britanie) au fost aplicați în diluție 1: 100 după tratarea prealabilă a lamelelor cu tampon de citrat de sodiu (10 mM citrat de sodiu, 0,05% Tween 20, pH 6,0, preîncălzit la fierbere în conformitate cu protocolul de recuperare a epitopului indus de căldură recomandat de producător). Dezvoltarea semnalului a fost efectuată prin procedura imunoperoxidazei; lamele au fost contracolorate cu hematoxilină.

Celulele Sox9 + și CK19 + au fost numărate manual pe diapozitive imunocolate, iar indicii corespunzători au fost calculați ca proporții de celule pozitive (%).

Analiza Western-blot

Conținutul de proteine ​​Sox9 și citokeratină 19 (CK19) din țesuturile hepatice a fost cuantificat prin analiza Western-blot utilizând echipamentele, consumabilele și protocoalele de către Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, SUA). Izolarea proteinelor din țesutul hepatic a fost efectuată folosind kitul de lizie celulară MicroRotofor ™, conținutul total de proteine ​​a fost măsurat prin testul Bradford utilizând Quick Start ™ Bovine γ-Globulin Standard și Trans-Blot® Turbo ™ RTA Mini LF PVDF Transfer Kit a fost utilizat pentru transferul proteinelor rezolvate de la gel la membrana de șters a fluorurii de poliviniliden. Alte produse Bio-Rad, utilizate în această secțiune, au inclus conjugatul Immun-Star Goat Anti-Rabbit (GAR) -HRP ca anticorpi secundari, Clarity ™ Western ECL cu sistemul ChemiDoc ™ pentru dezvoltarea semnalului și software-ul Image Lab ™ pentru analiza datelor. Anticorpii primari împotriva Sox9, CK19 sau β-tubulină (toți de Abcam) au fost aplicați în diluții 1: 100, conform recomandărilor producătorului.

Reacția în lanț a polimerazei (PCR)

Expresia markerilor moleculari a fost analizată prin transcripție inversă cantitativă în timp real PCR. Felii de țesut din ficat, plămân sau rinichi, fiecare cu un volum de aproximativ 30 mm 3, au fost scufundate în reactiv de stabilizare ARN mai târziu (QIAGEN, Hilden, Germania) imediat după recoltare, incubate peste noapte la 4 ° C și depozitate la - 80 ° până la utilizare. Țesutul din lobii excizați ai ficatului a fost utilizat ca referință pentru analiza expresiei genice la ficatul regenerant; fragmente de plămâni și rinichi de la animale intacte au fost utilizate ca probe de referință pentru analiza expresiei genelor în organele corespunzătoare ale animalelor operate.

ARN-ul total a fost izolat din probele de țesut folosind RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) conform protocolului producătorului. Concentrația estimată de ARN purificat în eluat a fost de 0,1 g/l; calitatea materialului a fost controlată prin electroforeză.

Pentru a elimina urmele de ADN genomic, ARN-ul a fost tratat cu o soluție apoasă de DNază I, fără RNază (Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA; 1 U per μg de ARN, în prezența Mg 2+, urmat de inactivarea termică a ADNsei conform protocolului producătorului); eficacitatea a fost confirmată prin PCR cu primeri specifici regiunilor genomice netranscrise. Transcrierea inversă a ARN-ului total către ADNc monocatenar amorsat aleatoriu a fost făcută folosind MMLV RT Kit (Evrogen CJSC, Moscova, Rusia); sinteza a fost efectuată la 39 ° C timp de 1 oră. După inactivarea termică a enzimei, amestecul de reacție a fost diluat cu 2 volume de tampon TE (10mM Tris pH 8,0, 0,1mM EDTA) pentru utilizare și depozitare ulterioară; diluarea finală a amestecului în PCR a constituit 1: 250.

Reacțiile în lanț ale polimerazei au fost stabilite în duplicate pe baza qPCRmix-HS SYBR (Evrogen CJSC) cu primeri oligonucleotidici (personalizați de SYNTOL, Moscova, Rusia) în concentrații finale de 0,2-0,4 μM. Structurile oligonucleotidelor cu simboluri și descrieri ale țintelor corespunzătoare sunt date în Tabelul 1. Amplificarea cu detectare și analiză digitală a fluorescenței în timp real a fost efectuată pe DT-96 Real-Time PCR Cycler (DNA-Technology JSC, Moscow, Rusia) în modul standard de 95 ° C timp de 5 minute urmat de (95 ° C 15 s, 62 ° timp de 10 s + citire, 72 ° timp de 20 s) × 45.