Petre Shotadze Tbilisi Medical Academy, G. Eliava Institute of Bacteriophages, Microbiology and Virology, Georgia

* Autor corespondent: Taras Gabisonia
Petre Shotadze Tbilisi Medical Academy
Institutul de bacteriofagi G. Eliava
Microbiologie și virologie, Georgia
Tel: +99577423225
E-mail: [e-mail protejat]

Data primiriiStk #: 03 decembrie 2019; Data acceptată: 20 decembrie 2019; Data publicării: 27 decembrie 2019

Citare: Gabisonia T, Loladze M, Zarnadze M, Kekenadze N, Lomidze M, și colab. (2020) Studiul agenților patogeni E.coli care cauzează infecții intențioanale și utilizarea preparării bacteriofagului-fagul Coli. Arch Clin Microbiol Vol. 11 Nr. 1:99

Abstract

Conform datelor Organizației Mondiale a Sănătății (OMS), aproximativ 2 miliarde de persoane se îmbolnăvesc anual de infecții intestinale. Agenții patogeni care se răspândesc prin alimente și apă sunt principalele cauze ale bolii și mortalității; acestea duc la moartea a aproximativ 1,8 milioane în fiecare an. Rezultând din problema menționată, are o importanță deosebită efectuarea cercetării microbiologice și moleculare a agenților patogeni bacterieni care cauzează infecții intestinale. Unul dintre principalii agenți patogeni, care se răspândește prin ape, este o varietate de Salmonella, patogen Escherichia coli și Shigella. Monitorizarea agenților patogeni legați de alimente și apă ar facilita procesul de reducere a frecvenței acestora în mediu, ceea ce, de la sine, ar reduce riscul de răspândire a bolilor cauzate de agentul patogen menționat în rândul oamenilor. Identificarea timpurie a acestor agenți patogeni are importanța vitală pentru un tratament rapid și eficient.

Cuvinte cheie

Agenți patogeni; E coli

Introducere

Alternativa pentru antibiotice sunt medicamentele comerciale pentru fagi, printre care se numără bacteriofagul Coli, care conține bacteriofagi specifici, care are bacteriofagi specifici împotriva E. coli patogen. Utilizarea medicamentelor pe bază de fagi este inofensivă pentru corpul uman, deoarece fagii au doar activitate de liză către bacteriile patogene [11,12].

Lucrarea prezentată aici își propune să identifice E. coli patogen care cauzează infecții intestinale în probele clinice, precum și în alimente (carne de vită). Pentru a defini sensibilitatea antibioticelor față de tulpinile menționate, de asemenea, împreună cu medicamentul comercial pentru fagi - Coli Phage, a cărui structură conține bacteriofagi împotriva E. coli patogen. În plus, pentru a determina sensibilitatea tulpinilor patogene față de acest medicament.

Materiale și metode

Izolarea tulpinilor de E. coli

Pentru izolarea tulpinilor de E. coli, o buclă din specimenele diluate a fost inoculată în agar MacConkey și incubată la 37 ° C timp de 18-24 ore. Coloniile bacteriene au fost identificate pe baza morfologiei brute, a unui număr de colonii și a modelului hemolitic. Testele biochimice și serologice adecvate au fost efectuate pe coloniile izolate pentru a identifica agenții patogeni.

Serogruparea izolatelor de E. coli

Serogrupurile de E. coli au fost identificate serologic prin testul de aglutinare cu diapozitive folosind antiseruri standard de E. coli polivalente și monovalente (O114, O86, O26, O55, O36, O111, O119, O125, O126, O142, O157) conform Edwards și Ewing (1972) ) [13].

Testarea susceptibilității antimicrobiene

Pentru a analiza profilul anti-biogramă al izolatelor, toate tulpinile izolate de E. coli au fost testate pentru sensibilitate la 15 agenți antimicrobieni diferiți, care sunt cei mai utilizați în clinici: penicilină (P), ampicilină (A), carbenicilină (Cb), ampiox (Ap) cloramfenicol (C), streptomicină (S), tetraciclină (T), gentamicină (G), kanamicină (K), eritromicină (E), meticilină (M), fortum (F), cefamezină (Cf), ketotefen ( Kt), claforan (Cl) Azithromycin (Az), Ciprofloxacin (Cip), Imipenem (Im), Cefazoline (Cef), Polymoxin (Pm). Sensibilitatea acestor izolate la agenți antimicrobieni a fost realizată prin metoda de difuzare a discului în conformitate cu standardele Comitetului Național pentru Standarde de Laborator Clinic [14].

Sistem de identificare a bacteriilor din grupul intestinal

Reprezintă un sistem standardizat, care conține 21 de mini teste biochimice și este aplicat pentru a identifica bacteriile din grupul gastro-intestinal și alte bacterii gram-negative.

Principiu

Api 20 E constă din 20 de micro-eprubete, care conțin substraturi deshidratate. Suspensia bacteriană introdusă în bandă intră în reacție cu un substrat dat. În timpul incubației, culoarea se schimbă, ceea ce ar putea fi definit direct sau prin adăugarea reactivilor.

Procesul de citire a reacțiilor se realizează prin utilizarea tabelului interpretativ respectiv.

În timp ce se acumulează rezultate pozitive, se creează profilul digital și, prin catalogul analitic respectiv, se definesc numele și varietatea cauzei.

Izolarea bacteriofagului

Bacteriofagii au fost izolați din apele uzate prin filtrare, urmat de adăugarea de concentrat de bulion și culturi de 18 h de diferite tulpini (tulpini de testat) la filtrat. După 24 de ore de incubație într-un termostat, amestecul a fost filtrat prin filtre cu un diametru al porilor de 0,45 μm (Millipore, Statele Unite), iar filtratele au fost testate la fața locului pentru prezența fagilor prin aplicarea filtrului (0,1 ml) pe gazonul tulpinii testate pe un mediu nutritiv solid. Rezultatul a fost considerat pozitiv dacă a existat o zonă de liză pe gazon în 18-24 ore de cultivare la 37 ° С [15]. Tulpinile bacteriofage foarte specifice au fost selectate și selectate prin metoda plăcii conform Gracia [16].

Clonarea bacteriofagilor prin izolarea repetată a plăcii unice

Fagii izolați din materialul inițial nu sunt uniformi. Amestecurile de diferite tipuri de fagi sunt frecvente, după cum se judecă după morfologia plăcii. Plăcile sunt de diferite dimensiuni determinate de mărimea virionului, viteza de reproducere a fagilor etc. Plăcile au alte trăsături caracteristice, cum ar fi claritatea marginilor lor, prezența unui halo și completitudinea compensării. O singură placă poate conține 10 7-10 9 virioni. O serie de considerații teoretice și practice necesită utilizarea liniilor de fagi (clone) „pure” în timpul terapiei. În acest scop, o placă de fag izolată este atinsă cu capătul fin al unei pipete Pasteur și se colectează specimen mic, supus diluării seriale, amestecat cu bacterii de placare și agar moale topit și întins pe o placă. Izolarea unei clone bacteriofage pure în mod fiabil necesită aproximativ 3-5 astfel de etape.

Microscopie electronică: Componența grupului de morfologie al bacteriofagilor a fost investigată prin metoda microscopiei electronice. Fagii cu un titru ridicat de> 10 10 CFU/ml au fost colorate negativ cu 1% acetat de uranil. Imaginile au fost obținute prin microscopie electronică de transmisie (JEM 100 SX, JEOL, Japonia) cu contrast negativ al preparatelor prin acetat de uranil.

Rezultate si discutii

Pentru a atinge obiectivele și scopurile definite, în cadrul proiectului am comunicat cu laboratorul clinic, de acolo am primit tulpini de E. coli derivate de la pacienți. Din laboratorul menționat am obținut diferitele E. coli derivate de la pacienți pentru cercetări ulterioare.

Din laboratorul bacteriologic al clinicii ni s-a dat-56 tulpină patogenă de E. coli. Agenții patogeni menționați au fost derivați din diferitele organe ale pacienților, după cum urmează: ureche, dis-bacterioză, puroi, rană, piele.

Prin prezenta, de la al doilea laborator bacteriologic ni s-au dat tulpini de E. coli patogen. Agenții patogeni menționați au fost derivați din diferitele organe ale pacienților, după cum urmează: ureche, dis-bacterioză, puroi, rană și piele. Din cel de-al doilea laborator bacterian, am fost predate cu 33 de tulpini de E. coli patogen.

În perioada aprilie-mai 2019, numărul diferitelor tulpini date, în conformitate cu procedurile de biosecuritate, din laboratoarele clinice microbiologice a fost totalizat 89.

Tulpinile menționate mai sus au fost cercetate în funcție de caracteristicile morfologice, culturale, biochimice, serologice și patogene (Figura 1).

studiul

Figura 1: Sisteme API în diagnosticul E. coli.

Pe baza specificului activității, am început, de asemenea, să efectuăm analize privind poluarea microbiologică a alimentelor, și anume a cărnii de vită și de porc (Figura 2).

Figura 2: Activitatea hemolitică a E. coli.

În total au fost studiate 20 de probe, din care în 16 cazuri au fost identificate E. coli.

Investigația proprietăților morfologice, culturale și a structurii antigenice a bacteriilor izolate a indicat faptul că tulpinile izolate de E. coli aparțin serotipurilor, cum ar fi O114 (30%), O26 (20%), O36 (25%), O125 15 %), O126 (10%).

Tulpinile patologice de E. coli derivate de la pacienți au fost evaluate pe baza rezistenței la antibiotice. Unele dintre tulpini au fost rezistente la: Azitromicină, Ciprofloxacină, Imipenem, Cefazolin, Polimoxină și cloramfenicol (Figurile 3 și 4). Majoritatea tulpinilor au fost rezistente la două și mai multe antibiotice.

Figura 3: Antibioticogramele diferitelor tulpini bacteriene.

Figura 4: Rezistența la antibiotice a tulpinilor de E. coli.

Au fost efectuate teste bacteriologice ale cărnii măcinate pentru a detecta contaminarea produselor menționate mai sus.

În total au fost evaluate 20 de probe, dintre care 16 probe au fost contaminate de E. coli. Aceste tulpini s-au caracterizat prin rezistență la două sau mai multe antibiotice, în unele cazuri, spre șapte antibiotice.

Tulpinile de E. coli derivate din carne măcinată au fost rezistente împotriva: Amicacinei, Azitromicinei, Polimixinei, Imipenemului. Fapt interesant de menționat este că tulpinile de E. coli derivate din carnea măcinată sunt rezistente la aceleași antibiotice (Amicacin, Azythromycin, Polymixin, Imipenem) ca și tulpinile de E. coli derivate de la pacienții din laborator (Figura 5). Testul de sensibilitate la antibiotice a evidențiat o rezistență ridicată (Figura 5).

Figura 5: Rezistența la antibiotice a tulpinilor de E. coli derivate din diferite surse.

22 de tulpini din 56 de E. coli obținute din clinica I au prezentat rezistență la antibiotice. Din 33 de tulpini de E. coli obținute din clinica II doar 9 izolate au evidențiat rezistență. Rezistența ridicată a fost prezentată din tulpinile izolate din carnea măcinată-32 rezistente și 7 tulpini multi-rezistente (rezistente la patru sau mai multe antibiotice).

Pentru izolarea bacteriofagilor eficace împotriva noilor tulpini de E. coli patogene izolate au fost investigate 40 de probe de apă de canalizare urbană, apă de râu și alte surse de mediu. Dintre acestea, 16 probe conțineau tulpini lizate de fagi de E. coli patogene. Pentru formularea preparării fagilor polivalenți cu cel mai larg spectru de acțiune și activitate litică ridicată, toți cei 16 fagi au fost caracterizați în funcție de intervalul gazdei. Acești fagi au fost testați împotriva celor 89 de noi tulpini clinice izolate de E. coli patogene și a 16 tulpini de E. coli izolate din alimente. Au fost selectate 6 faze denumite condiționat vB-Eco1, vB-Eco2, vB-Eco3, vB-Eco4, vB-Eco5 și vB-Eco6, cu intervale largi, complementare, care nu se suprapun, pentru caracterizare ulterioară. (Figurile 6-8).

Figura 6: Eficacitatea vB-Eco1 împotriva tulpinilor de E. coli.

Figura 7: Microfotografie electronică a fagului E. coli vB-Eco1.
Descriere: Siphoviridae. Dimensiune: cap: 50 nm × 50 nm coadă: 125 nm × 10 nm.

Figura 8: Fagul E. coli vB-Eco1.
Descriere: Myoviridae. Dimensiune: cap: 50 nm × 50 nm coadă: 120 nm × 15 nm.

A fost creat un preparat de fag pe baza a 6 bacteriofagi nou izolați și caracterizați, cu o gamă mare de activitate împotriva diferitelor tulpini de E. coli patogen. Acest preparat a fost eficient împotriva 89,9% din tulpinile investigate. Studiul a relevat că 80 din 89 de tulpini de E. coli erau sensibile la cocktailul de fagi Coli. De asemenea, 14 din 16 tulpini de E. coli derivate din carnea măcinată au fost 87,5% sensibile la cocktailul de fagi Coli (Figura 9).

Figura 9: Sensibilitatea tulpinilor de E. coli față de cocktailul de fagi Coli.

Având în vedere activitatea litică ridicată și spectrul larg al acestui preparat fag polivalent, acesta va fi o alternativă semnificativă pentru prevenirea și tratamentul colibacilozei cauzate de agenții patogeni E. coli multirezistenți.

Concluzie

Laboratorul bacteriologic al primei clinici a testat 56 de tulpini patogene care au fost rezistente la: Azitromicină, Ciprofloxacină, Imipenem, Cefazolin, Polimixină și Cloramfenicol.

• Laboratorul bacteriologic al celei de-a doua clinici a testat 33 de tulpini patogene care au fost rezistente la: Amicacin, Azythromycin, Ciprofloxacin, Imipenem, Polymixin. • 20 de probe de carne măcinată au fost studiate în aprilie-mai 2019. În 16 probe au fost detectate. Tulpinile au fost rezistente la două sau mai multe, în mai multe cazuri până la șapte antibiotice. Tulpinile derivate din carnea măcinată au fost rezistente la: Amicacin, Azythromycin, Imipenem, Polymixin. • Am produs fagii din cele 89 de tulpini derivate de la pacienți și 16 tulpini derivate din carnea măcinată și am creat cocktailul cu cei mai eficienți 6 fagi. 89,9% din tulpinile derivate din pacienți și 87,5% din tulpinile derivate din carne au fost sensibile la acest cocktail. Studiul a fost realizat în cadrul Academiei Medicale Petre Shotadze din Tbilisi și a fost finanțat prin proiectul de grant al academiei. O parte a fazei fagice a fost efectuată în Institutul de bacteriofagi, microbiologie și virologie G. Eliava.