Tehnicile de inginerie a proteinelor sunt o parte esențială a personalizării sau producerii proteinelor cu proprietăți specifice care pot fi aplicate în diferite procese industriale. Astfel, acestea sunt cruciale pentru cercetarea biotehnologică.

Thomas Leah

Cu toate acestea, aceste metode depind în mare măsură de capacitatea de a izola și purifica proteinele dorite, astfel încât proprietățile lor fizice și chimice să poată fi înțelese, împreună cu structurile lor terțiare și interacțiunile cu liganzi și substraturi.

Intensitatea la care se urmărește acest proces de purificare depinde de utilizarea la care trebuie pusă proteina. De exemplu, proteinele farmaceutice și alimentare trebuie să fie aduse la un grad ridicat de puritate și să treacă prin mai multe etape secvențiale, cât mai puține, deoarece la fiecare etapă se vor pierde inevitabil anumite proteine.

Purificarea moleculelor de proteine ​​este mai simplă decât purificarea complexelor proteice.

Pasul 1: Crearea unui extract de proteine ​​brute

Extractele brute de proteine ​​intracelulare sunt preparate prin lizarea celulei utilizând procese chimice sau mecanice. Resturile sunt apoi îndepărtate prin centrifugare. Supernatantul rezultat este o formă departe de a fi pură, fiind amestecat cu multe alte macro și micromolecule.

Proteinele extracelulare se obțin prin centrifugarea soluției și îndepărtarea celulelor. O metodă specifică pentru obținerea unui extract brut de enzime termostabile este încălzirea amestecului astfel încât să se denatureze alte proteine ​​și apoi să se răcească pentru a reforma proteinele termostabile de interes, centrifugându-l în final pentru a elimina proteinele denaturate.

Pasul 2: purificare intermediară

Sare

Proteinele dintr-un extract brut sunt apoi purificate prin precipitarea lor într-o soluție de sare foarte concentrată, cum ar fi sulfatul de amoniu. Acest lucru funcționează pe baza solubilității mai scăzute a proteinelor la concentrații mari de sare. Cu toate acestea, toate proteinele nu precipită la aceeași concentrație de sare, ceea ce înseamnă că sărarea ajută și la fracționarea proteinelor. Poate fi folosit și pentru concentrarea proteinelor în soluție. Această etapă crește puritatea de trei ori și 92% din proteina din soluție este recuperată.

Dializă

Proteinele sunt molecule mari și acest lucru înseamnă că sărurile proteice vor fi reținute prin trecerea soluției printr-o membrană semipermeabilă. Celuloza este o dializă membranară tipică. Dializa nu poate fi utilizată pentru a separa proteinele cu diferite greutăți moleculare.

Cromatografie

Alte tehnici utilizate pentru îndepărtarea proteinelor sărate includ cromatografia de excludere a gelului și filtrarea. Acestea sunt acum disponibile ca kituri preformate pentru multe proteine ​​standard și sunt adesea potrivite pentru procese pe scară largă.

Filtrarea pe gel funcționează pe baza separării mărimii printr-o coloană de bile de polimer poros, cum ar fi dextran sau agaroză. Moleculele mari pot curge doar prin spațiile dintre margele, în timp ce cele mai mici ocupă ambele spații și spațiul din interiorul mărgelelor, încetinindu-le. Astfel, eluantul conține molecule care apar în ordinea mărimii lor, de la cea mai mare la cea mai mică. Se utilizează, de asemenea, tehnici de cromatografie cu fază inversă sau schimb de ioni, care funcționează pe baza proprietăților diferențiale hidrofobe și, respectiv, a sarcinii. Cromatografia în fază inversă poate fi limitată în aplicarea sa datorită unei posibile denaturări a proteinelor de către solvenți organici.

Povești conexe

Dializa și schimbul de ioni au ca rezultat o soluție care este de 9 ori mai pură, dar doar 77% din proteina originală fiind acum disponibilă. După cromatografia de excludere pe gel, randamentul este de numai 50%, dar puritatea este de 100 de ori.

Pasul 3: Purificarea finală

Cromatografie de afinitate

Acest proces depinde de utilizarea liganzilor legați de margele care se leagă în mod specific de proteina de interes care poate fi apoi clătită cu o altă soluție de liganzi liberi. Acest lucru are ca rezultat probe de proteine ​​extrem de pure, care au cea mai mare activitate specifică dintre toate tehnicile utilizate în mod obișnuit. Un exemplu este purificarea concanavalinei A utilizând reziduuri de glucoză atașate la margele dintr-o coloană. Soluția este acum mai pură de 3000 de ori, dar randamentul este de doar 35% din proteina originală.

Electroforeza pe gel de poliacrilamidă

Electroforeza pe gel de poliacrilamidă este utilizată pentru a detecta puritatea probei de proteine ​​după fiecare etapă pe baza mărimii. Încărcarea netă pe moleculă o face să se deplaseze în jos pe coloana sau foaia de gel într-un câmp electric, făcând posibilă separarea proteinelor pe baza vitezei lor de migrare, care la rândul său depinde de încărcarea lor, precum și de frecare și câmp putere. Gelul acționează ca un filtru chimic inert și ușor de format, moleculele de proteine ​​fiind aproape imobile în coloană, deoarece sunt blocate între porii mult mai mici dintre moleculele gelului. Inițial este afișată o serie de benzi care reprezintă diferite proteine ​​din amestec, care se reduc treptat în număr până când etapa finală arată o singură bandă.

Imunoblotarea

Imunoblotarea este o altă tehnică utilă, adesea combinată cu cromatografia de afinitate. Folosește anticorpi pentru ca proteina să fie izolată ca liganzi în coloană. Uneori, anticorpul este atașat la izotopi sau coloranți pentru a le marca și pentru a facilita detectarea după separare.

Orice tehnică cromatografică este îmbunătățită prin utilizarea presiunii pentru a forța soluția printr-o coloană de materiale fin împărțite, indiferent dacă sunt mărgele încărcate sau legate de ligand. Suprafața crescută are ca rezultat o interacțiune mai mare care împinge rezoluția și viteza tehnicii în sus. Aceasta este denumită cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC).

Toți acești pași sunt incluși în schema ideală, care trebuie să se concentreze atât pe nivelurile de randament, cât și pe nivelurile de purificare, pentru a oferi cantități adecvate de proteine ​​pentru a trece printr-un experiment, precum și pentru a oferi suficientă puritate pentru a face interpretarea relativ simplă.

Referințe

Lecturi suplimentare

Dr. Leah Thomas

Dr. Liji Thomas este OB-GYN, care a absolvit Colegiul Medical al Guvernului, Universitatea din Calicut, Kerala, în 2001. Liji a practicat ca consultant cu normă întreagă în obstetrică/ginecologie într-un spital privat pentru câțiva ani după absolvire. Ea a consiliat sute de pacienți care se confruntă cu probleme legate de sarcină și infertilitate și a fost responsabilă de peste 2.000 de nașteri, depunând eforturi pentru a obține o livrare normală mai degrabă decât operativă.

Citații

Vă rugăm să utilizați unul dintre următoarele formate pentru a cita acest articol în eseu, lucrare sau raport:

Thomas, Leah. (2019, 26 februarie). Tehnici de purificare a proteinelor. Știri-Medical. Adus pe 19 decembrie 2020 de pe https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.

Thomas, Leah. „Tehnici de purificare a proteinelor”. Știri-Medical. 19 decembrie 2020. .

Thomas, Leah. „Tehnici de purificare a proteinelor”. Știri-Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx. (accesat la 19 decembrie 2020).

Thomas, Leah. 2019. Tehnici de purificare a proteinelor. News-Medical, consultat la 19 decembrie 2020, https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.

News-Medical.Net furnizează acest serviciu de informații medicale în conformitate cu acești termeni și condiții. Vă rugăm să rețineți că informațiile medicale găsite pe acest site web sunt concepute pentru a sprijini, nu pentru a înlocui relația dintre pacient și medic/medic și sfaturile medicale pe care le pot oferi.

News-Medical.net - Un site AZoNetwork