Chen Li 1,2,3 #, Xingfei Zhu 1,2 #, Chia-Ming Lee 3, Zhourui Wu 1,2, Liming Cheng 1,2

Contribuții: (I) Concepție și proiectare: C Li, Z Wu, L Cheng; (II) Sprijin administrativ: L Cheng; (III) Furnizarea de materiale de studiu sau pacienți: C Li, Z Wu; (IV) Colectarea și asamblarea datelor: CM Lee, X Zhu; (V) Analiza și interpretarea datelor: toți autorii; (VI) Scrierea manuscriselor: Toți autorii; (VII) Aprobarea finală a manuscrisului: Toți autorii.

# Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.

Fundal: Tot mai multe studii s-au concentrat pe tratamentul leziunii măduvei spinării (SCI) prin ingineria țesuturilor, dar încă nu există un model animal ideal care să poată simula în mod real și obiectiv procesul patologic real în practica clinică. De asemenea, având în vedere disponibilitatea și utilizarea crescândă a animalelor modificate genetic în cercetarea științifică de bază, a devenit esențial să se dezvolte modele clinice pentru SCI pentru utilizare la șoareci.

Metode: Patruzeci și opt de șoareci C57BL/6 au fost împărțiți în trei grupuri (răniți/simulați/nevătămați). Am determinat intervalul cicatricial făcut de prima leziune prin zdrobire prin observarea specimenului, colorarea hematoxilinei și eozinei (HE) și colorarea imunofluorescentă. Tranziția pentru îndepărtarea completă a unui segment de măduva spinării de 2 mm centrat pe nucleul leziunii a fost finalizată la 6 săptămâni după prima leziune în grupurile rănite, în timp ce grupul fals a suferit doar o reexpoziție a măduvei spinării fără leziune de tranziție. Caracteristicile acestui model SCI au fost pe deplin constatate prin observarea specimenului, colorarea HE, colorarea imunofluorescentă și reacția în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (qRT-PCR).

Rezultate: Nu au murit șoareci după prima leziune. Rezultatele histopatologice au sugerat un ciclu ciclic de 2 mm. După a doua operație, au murit 2 șoareci din grupul rănit și 1 șoarecel din grupul fals. Scorul Basso Mouse Scale (BMS) și rezultatele potențialului motor evocat (MEP) au arătat că funcția neurologică a șoarecilor nu și-a revenit. Imunomarcarea a arătat că nu au existat neuroni sau reziduuri de neurofilamente în nucleul leziunii la 4 săptămâni după a doua leziune. Astrocitele au încapsulat celule imune pentru a forma cicatrici gliale dense. Majoritatea celulelor imune au fost limitate la miezul leziunii și au format cicatrici fibroase cu fibroblaste. În același timp, a existat o angiogeneză considerabilă în nucleul leziunii și în jurul leziunii. Rezultatele qRT-PCR au arătat că Ptprc a fost extrem de exprimat în nucleul leziunii, în timp ce Gfap, nestin, Cnp și Sv2b au fost extrem de exprimate în regiunea adiacentă. Acest lucru sugerează că nucleul leziunii este o zonă foarte inflamatorie, dar poate exista neurogeneză spontană adiacentă nucleului leziunii.

Concluzii: Modelul SCI de tranziție completă a mouse-ului realizat de cele două operații are o simulare bună, fezabilitate ridicată și reproductibilitate ridicată; va fi un instrument util pentru testarea preclinică a tratamentului SCI.

Cuvinte cheie: Leziunea măduvei spinării (SCI); model animal; metoda chirurgicală; histopatologie

Trimis pe 09 septembrie 2019. Acceptat pentru publicare 02 ianuarie 2020.

Introducere

Leziunea măduvei spinării (SCI) a jucat întotdeauna un rol esențial în domeniul bolilor traumatice ale coloanei vertebrale din cauza incidenței sale ridicate, a ratei ridicate de invaliditate și a ratei reduse de recuperare (1,2). Până în prezent, tratamentul eficient și reabilitarea SCI rămân o problemă medicală dificilă la nivel mondial (3). Conform statisticilor recente, incidența SCI în lume este de 10,4-83/1 milion (4). Consecințele grave, cum ar fi paralizia cauzată de SCI, impun adesea sarcini substanțiale asupra familiilor și societății (5). Prin urmare, stabilirea unui model animal standard și ideal al SCI este o condiție prealabilă pentru studiul experimental al SCI.

În ultimii 10 ani, s-au înregistrat progrese semnificative în tratamentul SCI prin implantarea celulelor stem și a materialelor biologice funcționale în siturile rănite, îmbunătățind astfel micro-mediul, activând celulele stem neuronale endogene și promovând regenerarea neuronilor și axonilor ( 6-9). Cu toate acestea, majoritatea acestor metode se bazează pe modele animale acute SCI, cum ar fi modelul de tranziție ascuțită (10,11), modelul de rănire prin comprimare (12), modelul de rănire prin zdrobire (13), modelul complet de leziune de tranziție (9) și așa el. Aceste studii au transplantat celule sau biomateriale imediat după SCI, eludând efectele cicatricilor gliale și cicatricilor fibroase asupra regenerării nervilor. Cu toate acestea, în lucrările clinice, din cauza prognosticului imprevizibil cauzat de limitarea tehnicilor de diagnostic existente (14), în stadiul incipient al leziunii, în care materialele de speriat încă nu s-au format, majoritatea pacienților nu sunt de acord cu transplantul chirurgical de tulpină celule, biomateriale sau alte tratamente, cu excepția cazului în care nu există nicio îmbunătățire a paraliziei pe termen lung. Prin urmare, îndepărtarea țesutului cicatricial este esențială pentru tratamentul SCI. Stabilirea unui model animal adecvat de îndepărtare a țesutului cicatricial poate simula cu acuratețe, realism și obiectiv procesul real de tratament clinic în practica clinică.

Metode

Chirurgie la animale

Test de câmp deschis

Testul de câmp deschis Basso Mouse Scale (BMS) a fost utilizat pentru a evalua funcția motorie a membrelor posterioare la șoareci. În mod dublu orb, șoarecii au fost evaluați o dată pe săptămână înainte și după rănire de către aceiași doi observatori care nu erau conștienți de condițiile experimentale.

Analiza electrofiziologică

Testarea electrofiziologică a fost efectuată pentru fiecare grup utilizând potențialul evocat cu două canale Keypoint II/electromiografie (Dantech) în fiecare săptămână după prima leziune și a patra săptămână după a doua leziune. Toate animalele au fost anesteziate prin injecții intramusculare (IM) de ketamină (20 mg/kg). Potențialul evocat motor (MEP) se referă de obicei la potențialul de acțiune provocat de stimularea cortexului motor. Pentru înregistrarea MEP, au fost incluși 2 electrozi de stimulare: electrodul pozitiv a fost plasat pe suprafața craniului zonei motorii a cortexului cerebral [antero-posterior (AP) ± 1,0, stânga/dreapta ± 1,5, dorso-ventral (DV) 0, mm de bregma], 1 mm în spatele bregmei și 1,5 mm pe partea stângă sau dreaptă de la linia mediană; iar electrodul negativ a fost plasat pe craniu 0,5 cm lateral față de electrodul pozitiv. Electrodul de înregistrare a fost introdus în mușchiul gastrocnemius stâng sau drept al membrelor posterioare la o adâncime de 1,5 mm.

Mai mult, electrodul de referință a fost plasat la 2 cm distanță de electrodul de înregistrare, iar linia de împământare a fost plasată în mijlocul electrodului de stimulare și al electrodului de înregistrare. O undă pătrată simplă de 0-10 mA (1 Hz) a fost aplicată pentru a stimula zona motorie a cortexului cerebral prin craniu cu o durată de 0,2 ms. Două caracteristici ale MEP au fost înregistrate la mușchiul gastrocnemius al membrului posterior; adică, amplitudinile vârf-la-vârf au fost calculate ca valori de amplitudine și timpul de debut al primului răspuns la stimul a fost măsurat ca latență (16).

Prelucrarea țesuturilor

După inhalarea excesivă de izofluran, animalele au fost perfuzate transcardic cu 4% poliformaldehidă (PFA, Sigma, St. Louis, SUA) și soluție salină tampon fosfat (PBS, pH 7,4, Sigma). Măduva spinării a fost îndepărtată și plasată peste noapte în 4% PFA la 4 ° C, apoi transferată la 30% zaharoză (Sigma) de două ori și plasată peste noapte la 4 ° C. Probele au fost fotografiate la microscop (Nikon), apoi folosind medii de încorporare a țesuturilor (Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA), iar o măduvă spinării de 1 cm centrată pe miezul leziunii a fost încapsulată pe gheață uscată. Secțiunile de țesut au fost tăiate la o grosime de 15 folosind folosind un feliator înghețat (Leica, Wetzlar, Germania) și montate pe lamele de sticlă încărcate. Secțiunile au fost colorate de HE (Sigma) pentru a vedea structura histologică a țesutului lezional.

Imunohistochimie

Secțiunile au fost spălate de 3 ori cu 1 × PBS și apoi incubate cu anticorpii primari la 4 ° C peste noapte după 1 h blocare cu 5% ser normal de capră (NGS, Sigma) și 0,2% Triton X-100 (Sigma). Secțiunile au fost apoi incubate la temperatura camerei timp de 2 ore cu anticorpi secundari marcați fluorescent (Invitrogen, Waltham, MA, SUA) și spălate cu 0,01 M PBS de 3 ori înainte de a fi observate la un microscop confocal cu scanare laser (Zeiss, LSM800). Imunohistochimia fluorescenței a fost efectuată folosind următorii anticorpi primari: iepure anti-NeuN (Abcam, Cambridge, MA, SUA; 1: 500), pui proteina asociată cu microtubuli 2 (Map2) (Abcam, 1: 500), iepure anti- proteină acidă fibrilară glială (Gfap) (Dako, St. Clara, CA, SUA; 1: 1.000), șobolan anti-Cd45 (eBioscience, Waltham, MA, SUA; 1: 500), marker anti-neurofilament purificat (pan axonal, cocktail, SMI-312) (Biolegend, San Diego, CA, SUA; 1: 1.000), șoarece anti-fibronectină (Fn1) (Abcam, 1: 200), șobolan anti-CD11b (eBioscience, 1: 500), cobai molecula adaptor anti-ionizată de legare a calciului 1 (IBA1) (Synaptic Systems, Goettingen, Germania; 1: 800), iepure anti-CD34 (Abcam, 1: 250).

Cuantificarea imaginii

Pentru fiecare grup de animale experimentale (N≥3), au fost selectate felii care conțin canalul spinal central. Zonele țintă sunt fotografiate de un obiectiv obiectiv de 20 × fără zoom optic prin microscopie de scanare laser confocală la o rezoluție de 1.024 × 1.024 pixeli. Fiecare regiune a fost scanată de-a lungul axei Z la intervale de 1,5-2,5 µm. O imagine finală 3D de înaltă definiție a fost realizată prin reconstrucția acestor scanări consecutive folosind software-ul Imaris (Bitplane). Am folosit apoi Imaris pentru a număra celulele și a semnaliza zonele din diferite regiuni. Toate figurile au fost compuse cu Adobe Photoshop, Graphpad Prism și Adobe Illustrator.

Reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (qRT-PCR)

Sub anestezie indusă de izofluran, țesutul proaspăt al măduvei spinării din zona țintă a fost obținut la microscop. ARN-ul total a fost izolat prin TRIzol (Invitrogen) și purificat prin RNeasy Mini Kit (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. ARN-ul total a fost izolat de TRIzol și purificat cu RNeasy Mini Kit (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. Kitul PrimeScript RT (TAKARA) a fost folosit pentru a produce ADNc. PCR în timp real a fost efectuat folosind kitul TAKARA SYBR Premix Ex TAQ (Tli RNaseH Plus) și detectorul de secvență ABI 7900 (Applied Biosystems). Eficiența și specificitatea fiecărei perechi de grund au fost examinate prin curbe standard ale funcțiilor cADN-ului diluat continuu și respectiv a curbelor necatenate. După normalizarea la nivelul de transcripție a genei de menaj GAPDH, modificările multiple au fost calculate pe baza metodei de 2 −ΔΔCt. Secvența primerilor utilizați în qRT-PCR este prezentată în Tabelul 1.

măduvei

analize statistice

Graphpad Prism a fost folosit pentru statistici. Datele au fost exprimate ca medie (± SD). Testul t al studentului și testul t al studentului nepereche au fost utilizate pentru a determina diferența statistică dintre cele două grupuri. P

Rezultate

În prima operațiune a fost stabilit un model stabil de șoc T9 SCI

Îndepărtarea segmentului măduvei spinării de 2 mm centrat pe nucleul leziunii în timpul celei de-a doua operații s-a bazat pe modificările histopatologice ale leziunii prin zdrobire

Diferența de exprimare a genei între nucleul leziunii și zona periferică indică faptul că modelul are potențial de reparare

Discuţie

În cazurile clinice, SCI este de obicei rezultatul unui impact brusc și al unei compresii susținute care apare atunci când vertebrele coloanei vertebrale sunt rupte sau dislocate (27). În prima intervenție chirurgicală, metoda de leziune a clemei pe care am ales-o nu numai că a menținut integritatea duramaterului, dar s-a asemănat și cu leziunea clinică de zdrobire cauzată de deplasarea fracturii, hernia de disc etc. (28) la măduva spinării. În primele 24 de ore după leziune, stadiul hiperacut al SCI este caracterizat de un număr mare de reacții de stres precoce. Din a treia zi până în a șaptea zi, studiile au constatat că inflamația și apoptoza celulară ating treptat valoarea maximă, care este stadiul acut al SCI. Din prima zi până în săptămâna 2, care este stadiul subacut, diferite reacții patologice cedează treptat. În cele din urmă, la 2 săptămâni după leziune este considerat a fi stadiul cronic, din cauza recuperării comportamentale și electrofiziologice a animalelor, însoțită de modificări genetice stabile la nivel transcripțional (22,29-32). Modificările de mai sus sunt, de asemenea, în concordanță cu rezultatele noastre experimentale.

Concluzii

În concluzie, acest studiu demonstrează că modelul SCI de excizie completă a cicatricilor prin a doua operație la șoareci are o simulare bună, fezabilitate ridicată și reproductibilitate ridicată și va fi un instrument util pentru testarea preclinică în tratamentul SCI.

Mulțumiri

Finanțare: Această lucrare a fost susținută de subvenții de la Programul cheie de stat al Fundației Naționale pentru Științe Naturale din China (nr. 81330030) și Programul național de cercetare și dezvoltare cheie al Chinei (nr. 2016YFA0100800).

Notă de subsol

Conflictele de interese: Autorii nu au conflicte de interese de declarat.

Declarație etică: Autorii sunt responsabili pentru toate aspectele lucrării, asigurându-se că întrebările legate de acuratețea sau integritatea oricărei părți a lucrării sunt investigate și rezolvate în mod corespunzător. Toate procedurile experimentale au fost aprobate și efectuate în conformitate cu standardele Comitetelor pentru bunăstarea animalelor de la Universitatea Tongji din Shanghai, China [Nr. 2017-DW- (020)].