A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Yasutake Tanaka, Masahiro Ono

scăzută

Roluri Curarea datelor, Analiza formală, Investigație, Metodologie, Administrarea proiectelor, Vizualizare, Scriere - schiță originală, Scriere - revizuire și editare

Departamentul de afiliere pentru bioștiință și biotehnologie, Laboratorul de chimie a nutriției, Facultatea de Agricultură, Școala postliceală, Universitatea Kyushu, Fukuoka, Japonia

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Yasutake Tanaka, Masahiro Ono

Roluri Analiză formală, Investigație, Metodologie, Administrare proiect, Vizualizare, Scriere - schiță originală, Scriere - revizuire și editare

Departamentul de afiliere pentru bioștiință și biotehnologie, Laboratorul de chimie a nutriției, Facultatea de Agricultură, Școala postliceală, Universitatea Kyushu, Fukuoka, Japonia

Roluri Analiză formală, investigație, metodologie, vizualizare

Departamentul de afiliere pentru bioștiință și biotehnologie, Laboratorul de chimie a nutriției, Facultatea de Agricultură, Școala postliceală, Universitatea Kyushu, Fukuoka, Japonia

Roluri Analiză formală, investigație, metodologie, vizualizare

Departamentul de afiliere pentru bioștiință și biotehnologie, Laboratorul de chimie a nutriției, Facultatea de Agricultură, Școala postliceală, Universitatea Kyushu, Fukuoka, Japonia

Investigarea rolurilor, metodologie, vizualizare, scriere - schiță originală

Departamentul de afiliere pentru bioștiință și biotehnologie, Laboratorul de chimie a nutriției, Facultatea de Agricultură, Școala postliceală, Universitatea Kyushu, Fukuoka, Japonia

Investigarea rolurilor, metodologie, resurse, scriere - recenzie și editare

Departamentul de afiliere pentru bioștiință și biotehnologie, Laboratorul de chimie a nutriției, Facultatea de Agricultură, Școala postliceală, Universitatea Kyushu, Fukuoka, Japonia

Roluri Conceptualizare, Resurse, Supraveghere, Scriere - revizuire și editare

Departamentul de afiliere pentru bioștiință și biotehnologie, Laboratorul de chimie a nutriției, Facultatea de Agricultură, Școala postliceală, Universitatea Kyushu, Fukuoka, Japonia

Conceptualizare roluri, curatarea datelor, analiză formală, investigație, metodologie, administrare proiect, software, supraveghere, scriere - schiță originală, scriere - revizuire și editare

Departamentul de afiliere pentru bioștiință și biotehnologie, Laboratorul de chimie a nutriției, Facultatea de Agricultură, Școala postliceală, Universitatea Kyushu, Fukuoka, Japonia

Roluri Conceptualizare, Resurse, Supraveghere, Scriere - revizuire și editare

Departamentul de afiliere pentru bioștiință și biotehnologie, Laboratorul de chimie a nutriției, Facultatea de Agricultură, Școala postliceală, Universitatea Kyushu, Fukuoka, Japonia

Conceptualizare roluri, curatare date, analiză formală, achiziție de finanțare, investigație, metodologie, administrare proiect, resurse, software, supraveghere, validare, vizualizare, scriere - schiță originală, scriere - revizuire și editare

Departamentul de afiliere Bioscience și Biotehnologie, Laboratorul de chimie nutrițională, Facultatea de Agricultură, Școala postliceală, Universitatea Kyushu, Fukuoka, Japonia

  • Yasutake Tanaka,
  • Masahiro Ono,
  • Motonori Miyago,
  • Takahisa Suzuki,
  • Yurika Miyazaki,
  • Michio Kawano,
  • Makoto Asahina,
  • Bungo Shirouchi,
  • Katsumi Imaizumi,
  • Masao Sato

Cifre

Abstract

Citare: Tanaka Y, Ono M, Miyago M, Suzuki T, Miyazaki Y, Kawano M și colab. (2020) Utilizarea scăzută a glucozei în ficat determină hipercolesterolemie indusă de dietă la șobolanii exogen hipercolesterolemici. PLoS ONE 15 (3): e0229669. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0229669

Editor: Juan J. Loor, Universitatea din Illinois, STATELE UNITE

Primit: 4 septembrie 2019; Admis: 12 februarie 2020; Publicat: 12 martie 2020

Disponibilitatea datelor: Datele care stau la baza rezultatelor prezentate în studiu sunt disponibile de la Zenodo (https://zenodo.org/) (rezervat doi: 10.5281/zenodo.3592646).

Finanțarea: Acest studiu (SM) a fost susținut de Societatea Japoneză pentru Promovarea Științei (JSPS) KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) [numărul grantului 24380071].

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Lista de abrevieri: Șobolan ExHC, șobolan hipercolesterolimic exogen; Războiul SD, războiul Sprague-Dawley; OGTT, test oral de toleranță la glucoză; HOMA-IR, evaluarea modelului homeostaziei ca indice de rezistență la insulină; TAG, triacilglicerol; NEFA, acid gras neesterificat; ANOVA, analiza varianței

1. Introducere

În acest studiu, am realizat două experimente cu trei tipuri de dietă, raporturi diferite de carbohidrați (glucoză, zaharoză și fructoză). După cum am raportat, șobolanii ExHC prezintă activități FAS scăzute, chiar dacă sunt hrăniți cu o dietă bogată în zaharoză [16]. Prin urmare, am efectuat experimentul 1 cu o ipoteză că șobolanii ExHC au avut un metabolism afectat al fructozei, care poate sări peste reacția limită a ratei glicolizei și să fie metabolizat mai rapid decât glucoza. În plus, am efectuat și experimentul 2 pentru compararea șobolanilor ExHC și congenici în condiții de hrană cu dietă bogată în fructoză. În experimentul 2, șobolanii congenici au fost folosiți pentru a observa în mod clar efectul Smek2. Pe baza rezultatelor, am evaluat relația dintre metabolismul glucozei și lipidelor la șobolanii ExHC și am relevat mecanismul patologic care stă la baza DIHC la șobolanii ExHC.

2. Materiale și metode

2.1 Animale și dietă

2.2 OGTT

OGTT a fost efectuat în ziua 8 a experimentului 1. Șobolanii au fost supuși la 16 ore de post și apoi administrat oral un bolus de glucoză (3 g/kg greutate corporală). Probele de sânge au fost obținute din vena cozii la 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 180 și 240 de minute după încărcarea glucozei. Concentrațiile de glucoză din sânge au fost măsurate utilizând un glucometru Accu-Chek ® Aviva Nano (Roche Diagnostics, Tokyo, Japonia). Probele de sânge la fiecare moment au fost colectate în capilare microhematocrit heparinizate (HIRSCHMANN ®; Hirschmann Laborgeräte GMbH & Co., Eberstadt, Germania) și centrifugate la 1.750 × g și temperatura camerei timp de 15 minute pentru a obține plasma. Nivelurile de insulină plasmatică au fost măsurate cu setul ELISA de insulină de șobolan (Shibayagi, Gunma, Japonia). Aria sub curbă (ASC) și aria incrementală sub curbă (iAUC) au fost calculate din nivelurile de glucoză și insulină din fiecare punct.

2.3 Analiza parametrilor serici și hepatici

Nivelurile serice de colesterol, TAG, acid gras neesterificat (NEFA, acid gras liber), glucoză, fosfolipidă și glicerină liberă au fost măsurate cu seturi de testare a enzimei (colesterol E-Test, trigliceride E-Test, NEFA C-Test, fosfolipid C-test, glucoză CII-test: Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonia; Kit de testare a glicerinei: Cayman Chemical Company, Ann Arbor, SUA). Evaluarea modelului de homeostazie ca indice de rezistență la insulină (HOMA-IR) a fost calculată folosind următoarea formulă [20].

2.4 Determinarea FAS hepatic

Două grame de ficat au fost omogenizate în șase volume dintr-un tampon omogenizat răcit cu gheață conținând 0,25 M zaharoză, 1 mM EDTA și 10 mM Tris-HCI (pH 7,4). După ce fracțiunea nucleului a fost precipitată, supernatantul a fost centrifugat la 10.000 × g și 4 ° C timp de 10 minute pentru a separa fracția mitocondrială. Supernatantul rezultat a fost re-centrifugat la 125.000 × g și 4 ° C timp de 60 min pentru a precipita microsomii, iar supernatantul rămas a fost utilizat ca fracție de citosoli. Nivelurile de proteine ​​au fost determinate conform metodei de Lowry și colab. [21], iar BSA a fost folosit ca standard. Activitățile enzimatice ale FAS în fracția de citosoli au fost determinate folosind metoda lui Buang [22].

2.5 Determinarea nivelurilor de ARNm hepatic

ARN celular total a fost izolat din țesutul hepatic folosind metoda fenol/cloroform [23]. ADN-ul complementar (ADNc) a fost sintetizat din 1,0 μg din ARN-ul total utilizând un kit de sinteză ADNc cu catenă primă transcriptor (Roche, Berlin, Germania). Nivelul de expresie pentru fosfofructokinază (Pfkl) a fost analizat folosind reacția în lanț cantitativă în timp real cu transcripție inversă a polimerazei (RT-PCR) cu un kit SYBR Premix EX Taq II și un sistem în timp real de zaruri termice Cycler TP800 (TaKaRa, Shiga, Japonia). Nivelurile de ARNm au fost normalizate folosind gena β-actină (Actb) ca standard intern. Exemplele de secvențe utilizate pentru analiză au fost după cum urmează: Actb (R): 5′-TCATGGATGCCACAGGATTC-3 ′ .

2.6 Eșantionarea hepatocitelor primare de șobolan

Ficatul șobolanilor ExHC și Congenic (n = 4/tulpină) postit 24 de ore a fost perfuzat din vena portă în atriul drept cu soluție de acid etilen glicol tetraacetic (EGTA) (Tabel S2) și soluție de colagenază (Tabel S3) sub anestezie. Ficatele au fost colectate în soluție de colagenază și incubate la 37 ° C timp de 10 minute. După filtrarea cu tifon, hepatocitele colectate au fost spălate de 3 ori prin centrifugare (50 x g timp de 2 minute) și resuspendate în soluția Hanks (tabelul S4). Hepatocitele au fost resuspendate în mediu Williams E (mediu WE) conținând 10% FBS la 5 × 105 celule/ml și însămânțate într-un vas acoperit cu colagen. După 3 ore de incubație la 37 ° C, mediul a fost schimbat pentru a îndepărta hepatocitele moarte. După 24 de ore de incubație, hepatocitele primare au fost utilizate pentru alte experimente.

2.7 Analiza metaboliților solubili în apă la hepatocitele primare de șobolan (analiza metabolomului nețintă)

Metaboliții solubili în apă din lizatul hepatocitar primar de șobolan au fost analizați conform unui protocol descris anterior [24]. Concentrațiile în aceeași celulă ale hepatocitelor primare ale șobolanilor ExHC și congenici au fost colectate în PBS și apoi sonicate pentru a obține lizatul celular. Acest lizat (50 μl) a fost utilizat pentru analiza metabolomului efectuată așa cum s-a descris anterior [24]. Metaboliții extrasați din lizatul celular au fost derivatizați cu clorhidrat de metoxamină și N-metil-N-trimetilsilil-trifluoracetamidă și detectați prin analiza spectroscopiei de masă prin cromatografie în fază gazoasă (GCMS-QP2020, SHIMAZU). Digitalizarea fiecărui vârf și identificarea datelor despre metaboliți au fost efectuate cu software-uri analitice gratuite (MetAlign, MetaboAnalyst). Valorile fiecărui metabolit au fost ajustate în raport cu standardul intern. Din toți metaboliții identificați, datele despre metaboliți au fost extrase în următoarele condiții.

  1. Intensitatea medie a QC (măsurată prin amestecarea tuturor probelor) este de 1000 sau mai mult
  2. Valoarea coeficientului de variație (CV) al QC este de 100% sau mai puțin
  3. Intensitatea goală (numai solvent) este de 20% din intensitatea medie QC sau mai mică
  4. Valoarea CV-ului în cadrul grupului este de 150% sau mai puțin

2.8 Analiza statistică

Toate valorile sunt exprimate ca medii și erori standard ale mijloacelor (SEM). În OGTT, nivelurile de glucoză din sânge și insulină plasmatică au fost analizate folosind testul t Student între tulpini din aceleași grupuri de dietă. Celelalte date au fost analizate folosind analiza bidirecțională a varianței (ANOVA), iar diferențele au fost considerate semnificative statistic atunci când p a fost Tabelul 1. Parametrii de creștere, greutățile organelor și parametrii biochimici în Experimentul 1.

3.2 Parametrii serici.

Parametrii lipidici serici ai șobolanilor ExHC măsurați în Experimentul 1 au fost semnificativ mai mari (Tabelul 1). Comparativ cu dieta bogată în zaharoză, dieta bogată în amidon a crescut semnificativ nivelurile serice ale colesterolului total (Fig. 1A), esterul colesterolului și glicerolul liber și a scăzut semnificativ nivelurile serice de TAG. La nivelurile serice de NEFA, s-a observat o interacțiune între tulpină și dietă. Grupul cu conținut ridicat de zaharoză-ExHC a prezentat cele mai ridicate niveluri de ser NEFA. Dintre restul, grupul cu conținut ridicat de zaharoză-SD a prezentat niveluri serice mai ridicate de NEFA decât grupurile cu conținut ridicat de amidon-SD și cu amidon ridicat-ExHC.

(A) colesterol seric, (B) colesterol hepatic, (C) triacilglicerol seric, (D) triacilglicerol hepatic, (E) activitate a acidului gras hepatic sintază, (F) glucoză serică, (G) insulină serică, (H) glicogen hepatic, (I) glicogen muscular. Valorile sunt mijloace ± erori standard ale mijloacelor (SEM). Bara solidă și bara deschisă reprezintă datele SD, respectiv ExHC. n = 5/grup. Datele au fost analizate cu ANOVA bidirecțional, urmat de testul Tukey-Kramer ca test post-hoc. a, b: Diferite superscripturi arată diferențe semnificative la P Fig 2. Rezultatele testului de toleranță la glucoză pe cale orală.

(A - B) Nivelurile de glucoză din sânge și (C - D) nivelurile de insulină plasmatică după bolusul de glucoză (SD: pătrat deschis, ExHC: triunghi solid). (E) Zonele incrementale sub curba timp-concentrație (ASC) pentru glucoza din sânge. (F) ASC pentru insulina serică. Valorile sunt mijloace ± erori standard ale mijloacelor (SEM). n = 5/grup. Datele între tulpini în același timp după bolusul de glucoză au fost analizate utilizând testul t Student (A - D) sau ANOVA bidirecțional urmat de testul Tukey-Kramer (E - F). *: asteriscurile prezintă diferențe semnificative la P Fig 3. Expresii de ARNm hepatic Pfkl în Experimentul 1.

Expresiile ARNm hepatic Pfkl au fost măsurate utilizând RT-PCR în timp real (SD: bar solid, ExHC: bar deschis). Valorile sunt mijloace ± erori standard ale mijloacelor (SEM). n = 5/grup. Datele pentru au fost analizate cu ANOVA bidirecțional, urmat de testul Tukey-Kramer ca test post-hoc. N.S .: nu este semnificativ.

Experimentul 2

3.6 Parametrii de creștere și parametrii biochimici.

După consumul dietei bogate în fructoză, nu au fost observate diferențe semnificative în parametrii legați de dezvoltarea DIHC (Fig. 4). Greutățile creierului, WAT total și BAT ale șobolanilor congenici au fost semnificativ mai mari decât cele ale șobolanilor ExHC (Tabelul 2). Greutățile mușchilor femurali la șobolanii congenici au fost semnificativ mai mici decât cele ale șobolanilor ExHC (Tabelul 2). Parametrii biochimici ai serului și ai organelor au fost similari între tulpini (Tabelul 2).

(A) colesterol seric, (B) colesterol hepatic, (C) triacilglicerol seric, (D) triacilglicerol hepatic, (E) activitate a acidului gras hepatic sintază, (F) glucoză serică, (G) insulină serică, (H) glicogen hepatic, (I) glicogen muscular. Valorile sunt mijloace ± erori standard ale mijloacelor (SEM). Bara solidă și bara deschisă reprezintă datele SD, respectiv ExHC. n = 5/grup. Datele au fost analizate cu testul t Student.

3.7 Expresiile genei glicolizei hepatice.

Nivelurile de ARNm hepatic Pfkl la șobolanii congenici au fost semnificativ mai mari decât cele de la șobolanii ExHC (Fig. 5).

Expresiile de ARNm hepatic Pfkl au fost măsurate folosind RT-PCR în timp real (Congenic: bar solid, ExHC: open bar). Valorile sunt mijloace ± erori standard ale mijloacelor (SEM). n = 5/grup. Datele au fost analizate folosind testul t Student. *: asteriscurile prezintă diferențe semnificative la P Fig. 6. Metaboliți solubili în apă legați de metabolismul celular al glucozei la hepatocitele primare de șobolan.

Metaboliții solubili în apă au fost analizați cu hepatocite primare ale șobolanilor ExHC și ExHC.BN-Dihc2 BN. Săgețile solide și punctate reprezintă reacții directe și, respectiv, cu mai multe etape. Valorile sunt mijloace ± erori standard ale mijloacelor (SEM). n = 4/grup. Datele au fost analizate folosind testul t Student. *, **: asteriscurile prezintă diferențe semnificative la P Tabelul 3. Analiza metabolitului solubil în apă cu hepatocite primare ale ExHC și șobolani congenici.

4. Discutie

Nivelurile colesterolului seric observate în Experimentul 2 (ExHC: 474 mg/dL, congenic: 477 mg/dL) au fost mai mari decât cele din șobolanii SD din Experimentul 1 (dietă bogată în zaharoză: 111 mg/dL, dietă bogată în amidon: 189 mg/dL). Dieta bogată în fructoză duce la o creștere a nivelului colesterolului seric prin promovarea sintezei colesterolului hepatic [26]. Într-adevăr, în ambele tulpini ale experimentului 2, nivelul colesterolului hepatic, care a fost semnificativ mai mare în comparație cu cel din experimentul 1, a reprezentat în mod clar acest lucru. Acest fenomen este confirmat în mai multe modele de șobolani [27,28] și este, de asemenea, cunoscut ca fiind similar la oameni [29]. Conform acestor dovezi, nivelurile ridicate de colesterol seric din Experimentul 2 sunt considerate a fi efectul secundar al dietei bogate în fructoză.

În acest studiu, am confirmat creșterea semnificativă a greutății creierului prin consumul dietei bogate în amidon comparativ cu dieta bogată în zaharoză și scăderea semnificativă a greutății cerebrale a șobolanilor ExHC în comparație cu cele ale șobolanilor SD din acest studiu. Relația dintre carbohidrații dietetici și funcția creierului a făcut obiectul multor ani de cercetare [33,34]. Studii suplimentare privind funcțiile cerebrale ale șobolanilor ExHC pot furniza informații utile.

5. Concluzie

Disfuncția Smek2 provoacă o afectare a utilizării glucozei. Această afectare slăbește capacitatea de a sintetiza acizi grași în ficatul șobolanilor ExHC. Aceste tulburări secvențiale duc la DIHC la șobolanii ExHC.