Acest articol are o corecție. Te rog vezi:

Abstract

Mitocondriile sunt legătura dintre metabolismul energetic și, în consecință, disfuncția lor a fost implicată în dezvoltarea complicațiilor metabolice și progresia către rezistența la insulină și diabetul de tip 2. Cardiolipina unică tetra-acil fosfolipidă (CL) este localizată în membrana mitocondrială internă, unde menține integritatea mitocondrială. Aici arătăm că eliminarea Tafazzin (TAZ kd), o transacilază CL, la șoareci are drept rezultat protecția împotriva dezvoltării obezității, a rezistenței la insulină și a steatozei hepatice. Am stabilit că hipermetabolismul a protejat șoarecii TAZ kd de creșterea în greutate. În mod neașteptat, reducerea mare a CL în inima și mușchiul scheletal al șoarecilor TAZ kd nu a fost reflectată în ficat. Ca rezultat, șoarecii TAZ kd au prezentat formare supercomplexă mitocondrială hepatică normală și oxidare crescută a acidului gras hepatic. Colectiv, aceste studii identifică un rol cheie pentru remodelarea hepatică CL în reglarea susceptibilității la rezistența la insulină și ca o țintă terapeutică nouă pentru obezitatea indusă de dietă.

previne

Introducere

Obezitatea este acum o pandemie, prognozele a peste 1 miliard de adulți la nivel mondial fiind obezi până în 2030 (1) și costuri directe de peste 100 de miliarde de dolari/an în S.U.A. singur (2). Obezitatea este deosebit de devastatoare, deoarece excesul de lipide se acumulează în țesuturile non-adipoase, contribuind la rezistența sistemică la insulină și la un risc crescut de dezvoltare a diabetului de tip 2 (3). Disfuncția progresivă mitocondrială este asociată cu întreruperea lipotoxică a semnalizării insulinei, incluzând o scădere a funcției lanțului respirator, oxidarea redusă sau incompletă a acizilor grași (FAO) și supraproducția speciilor reactive de oxigen (ROS).

Cardiolipina (CL) reglează numeroase proteine ​​și procese mitocondriale ca urmare a structurii sale unice tetraacil și a localizării în membrana mitocondrială internă (4,5). În țesuturile cu rată metabolică ridicată, cum ar fi inima și mușchii scheletici, forma predominantă a CL constă din patru lanțuri laterale acil linoleice (L4CL) (4,5). Pierderea CL și/sau L4CL favorizează disfuncția mitocondrială. Acest lucru este subliniat de dezvoltarea sindromului Barth (BTHS), o boală genetică caracterizată prin deficit de L4CL, respirație mitocondrială afectată, cardiomiopatie dilatată și miopatie scheletică (5). Pacienții cu BTHS poartă mutații în gena Tafazzin (TAZ), care codifică o transacilază mitocondrială necesară pentru a încorpora acidul linoleic în CL (5).

Pierderea CL și/sau L4CL a fost demonstrată pe scară largă în modelele umane și animale de insuficiență cardiacă (4,6-8). O modalitate prin care conținutul de CL reglează disfuncția mitocondrială este prin implicarea directă în asamblarea și funcția supercomplexelor respiratorii (4). Acestea cuprind în principal complexul I (NADH - coenzima Q reductază), complexul III (ubiquinol - citocrom c reductază) și complexul IV (citocrom c oxidază) și funcționează pentru a promova fluxul eficient de electroni pentru a optimiza utilizarea substraturilor disponibile și pentru a controla producția de ROS (9). Celulele stem pluripotente induse dezvoltate de la pacienții cu BTHS au scăzut formarea supercomplexă, care coincide cu un consum redus de oxigen și o creștere a generației de ROS (10). Într-adevăr, pierderea conținutului de CL în insuficiența cardiacă este asociată cu activitatea redusă a complexelor respiratorii individuale și cu funcția respiratorie mitocondrială afectată (6,8).

În ciuda rolului CL în reglarea funcției mitocondriale, o asociere cu sindromul metabolic nu a fost examinată pe larg. Puținele studii care există indică faptul că obezitatea indusă de dietă promovează remodelarea patologică a CL (11-13). Cu toate acestea, rămâne neclar dacă nivelurile reduse de L4CL mitocondrială sunt suficiente pentru a iniția acumularea atipică de lipide în țesuturile neadipoze și pentru a perturba semnalizarea insulinei. Am investigat rolul nivelurilor CL și L4CL în dezvoltarea obezității induse de dietă și a rezistenței la insulină cu utilizarea unui model de șoarece TAZ knockdown (kd) (14). Rezultatele noastre stabilesc că TAZ kd previne dezvoltarea steatozei hepatice și a obezității care duce la rezistența la insulină. Mai mult, în ciuda deficitului de TAZ, nivelurile hepatice de CL au fost normale și supercomplexele menținute, oferind un mediu capabil să promoveze FAO crescută și hipermetabolismul responsabil pentru un fenotip slab.

Proiectare și metode de cercetare

Animale

Analiza mitocondrială

Peroxidul de hidrogen mitocondrial (H2O2) a fost cantitativ folosind reactivul Amplex UltraRed. Supercomplexele mitocondriale (25 μg proteină) au fost separate prin Blue Native PAGE, iar complexele individuale au fost vizualizate folosind teste de activitate în gel (4). Rata consumului de oxigen (OCR) a fost măsurată din hepatocite de șoarece (2 × 10 4/godeu) și fibre musculare scheletice (10 μg proteină/godeu) izolate din flexorul digitorum brevis folosind un instrument Seahorse Bioscience. Mediul conținea fie 1 mmol/L piruvat și 25 mmol/L glucoză pentru metabolismul glucozei sau 1 mmol/L piruvat, 2,5 mmol/L glucoză, 0,5 μmol/L carnitină și 0,155 mmol/L palmitat-BSA pentru acidul gras (FA) metabolism. Consumul bazal de oxigen a fost considerat a fi respirația bazală sensibilă la inhibarea de 1 μmol/L antimicină A plus 1 μmol/L rotenonă. Consumul de oxigen sensibil la ATP a fost inhibat de 1 μmol/L oligomicină, iar respirația insensibilă la ATP (căldură) a fost proporția rămasă din consumul de oxigen bazal. Consumul maxim de oxigen a fost atins cu 1 μmol/L cianură de carbonil 4- (trifluormetoxi) fenilhidrazonă (FCCP) pentru hepatocite sau 0,4 μmol/L FCCP pentru fibrele musculare scheletice. Respirația dependentă de FA este diferența în consumul de oxigen măsurată în prezența a 40 μmol/L etomoxir și a vehiculului (apă).

Western Blotting

Anticorpul monoclonal de șoarece crescut împotriva TAZ (Clona 2G3F7) a fost purificat de afinitate de laboratorul lui Steven Claypool de la Școala de Medicină a Universității Johns Hopkins (15).

Culturi primare de hepatocite

Culturile primare de hepatocite adulte de șoarece au fost izolate (16) și tratate cu DMEM fără ser conținând fie 2 μCi [14 C] oleat plus 0,4 mmol/L oleat-BSA, fie 2 μCi [14 C] acetat pe 2-ml farfurie. Lipidele totale au fost extrase (17) și speciile individuale au fost cuantificate așa cum s-a descris anterior (18).

Parametrii sângelui și țesuturilor

Nivelurile plasmatice ale factorului de necroză tumorală-α, insulină, leptină și adiponectină au fost cantitative prin ELISA (ALPCO). Kituri disponibile comercial au fost utilizate pentru măsurarea cetonelor plasmatice, FA neesterificate (Wako Diagnostics) și alanin aminotransferazelor (Biotron Diagnostics Inc.). Masa trigliceridelor (TG), fosfolipidelor, esterului colesterilic și colesterolului a fost determinată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (19) sau test de fosfor (20). Speciile moleculare de CL au fost cuantificate din omogenizate tisulare prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cuplată cu spectrometrie de masă cu ionizare prin electrospray (21). Lipoproteinele plasmatice au fost separate prin mărime utilizând cromatografie lichidă cu proteine ​​rapide pe un sistem de cromatografie Agilent 1200 cu o coloană Superose 6 (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) și kituri de testare enzimatică în linie (regentii Thermo Infinity) (22). Rata secreției hepatice de TG a fost măsurată după un post de 16 ore și injectarea de Poloxamer 407 (1 g/kg, i.p.) (23). Țesuturile au fost fixate în 10% formalină tamponată pentru colorarea hematoxilin-eozinei (5 μm) sau 4% paraformaldehidă pentru colorarea cu ulei roșu O (8 μm) și marcate folosind un sistem modificat de cel utilizat de Kleiner și colab. (24).

Analize statistice

Șoarecii TAZ kd sunt protejați de obezitatea indusă de dietă. A: Kd inductibil de Dox de proteină TAZ în Tg (T) comparativ cu șoareci NTg (N) a fost determinat prin imunoblot folosind mitocondrii izolate (25 μg inimă, 50 μg schelet [Sk.] Muscle și 100 μg ficat). Cuantificarea a fost efectuată cu citrat sintază (Cit) ca control al încărcării (n = 3-6). B: Greutatea corporală a șoarecilor Tg și NTg (n = 40). Masa corporală - atât slabă (C), cât și grasă (D) - a fost măsurată (n = 17). E: WAT gonadal colorat cu hematoxilin-eozină (HE; n = 5-10). F: Masa tamponului de grăsime gonadală pe greutatea corporală (b.w.) (n = 15-40) G: Steatoza macrovesiculară hepatică (macrovesică.) A fost marcată (n = 5-7). H și I: Plasma de la animalele de post a fost separată în VLDL, LDL și HDL și TG și s-a măsurat colesterolul total (Chol; neesterificat și esterificat) (n = 3-4). rel. amt, suma relativă. J: Ficat de la animale în vârstă de 10 luni colorate cu HE sau Oil Red O (ORO) (n = 5-14). Teste de toleranță la glucoză (K) și toleranță la insulină (L) (n = 12-28). Datele sunt mijloace ± SEM. * P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Parametrii plasmatici, hepatici și ai mușchilor scheletici la șoarecii cu deficit de TAZ

Scăderea greutății corporale a șoarecilor TAZ kd nu a putut fi explicată prin consumul redus de alimente, aportul de apă sau absorbția calorică intestinală (Fig. 2A - C). Alternativ, calorimetria indirectă a indicat că consumul de oxigen (Fig. 2D și H), producția de căldură (Fig. 2E și I) și activitatea (Fig. 2F și J) au fost semnificativ crescute la șoarecii TAZ kd comparativ cu NTg + dox coechipieri. O reducere a raportului de schimb respirator a indicat faptul că șoarecii TAZ kd consumau proporțional mai multe grăsimi decât carbohidrați în timpul ciclului de lumină (Fig. 2G și K).

Discuţie

Dovezi în creștere sugerează că disfuncția mitocondrială este centrală în perturbarea mediată de lipide a semnalizării insulinei în timpul obezității induse de dietă. În ciuda rolului bine stabilit al CL în reglarea funcției mitocondriale, o asociere cu sindromul metabolic nu a fost studiată pe larg. Scopul acestui studiu a fost de a testa dacă reducerea nivelurilor totale de CL și/sau L4CL a dus la disfuncții mitocondriale, ducând la acumularea de lipide atipice și la rezistența la insulină. Am stabilit că deficitul de TAZ a împiedicat obezitatea indusă de dietă după 10 luni de alimentație cu conținut scăzut de grăsimi și 16 săptămâni de hrană bogată în grăsimi. Reducerea semnificativă a lipidelor neutre atât în ​​ficat cât și în mușchiul scheletic a însoțit în mod corespunzător prevenirea rezistenței la insulină la animalele TAZ kd.

Rezumat schematic. La animalele de control NTg + dox, FA circulante sunt preluate de ficat și de mușchiul adipos și scheletic (Sk.) Și sunt stocate ca TG. Acumularea de lipide rezultată are efecte lipotoxice asupra semnalizării insulinei (Ins). În deficiența TAZ (Tg + dox), sinteza crescută a CL (CL Syn) menține nivelurile totale de CL necesare formării supercomplexului mitocondrial hepatic. Aceste supercomplexe asigură fosforilarea oxidativă mitocondrială eficientă (OXPHOS) pentru a sprijini generarea de căldură și ATP din creșterea FAO. Excesul total de FA este îndreptat către FAO hepatică și departe de depozitele de TG din ficat și mușchiul adipos și scheletal, rezultând o sensibilitate normală la insulină a întregului corp.

Datele noastre indică faptul că creșterea combinată a biosintezei CL hepatice și FAO previne evenimentele lipotoxice la șoarecii TAZ kd. Coordonarea acestor procese este justificabilă pe baza localizării subcelulare a ciclului β-oxidării și a mecanismului biosintetic CL de bază către matricea mitocondrială internă. Am stabilit anterior o legătură directă între sinteza CL și β-oxidarea mitocondrială (34,39). Activitatea MLCLAT-1 a fost crescută atunci când MTPa a fost exprimată în cultura celulară (39) și a scăzut la șoareci heterozigoți pentru MTPa (34). Deoarece tulburarea metabolică este strâns asociată cu pierderea CL, o creștere coordonată a remodelării FAO și CL poate fi o încercare a hepatocitelor de a menține producția normală de energie mitocondrială. Conținutul de CL hepatic și/sau L4CL a fost crescut în mai multe modele animale de diabet și boli hepatice grase nealcoolice, probabil ca o adaptare metabolică, deoarece activitatea complexului mitocondrial a fost menținută (13,40,41). Mai mult, s-a stabilit că creșterea coordonată a expresiei MTPa și a biosintezei CL a fost mecanismul molecular responsabil pentru activitatea complexă mitocondrială îmbunătățită și FAO și a redus producția de ROS la șoareci lipsiți de enzima de remodelare CL ALCAT1 (11).

În concluzie, am arătat că deficiența TAZ previne dezvoltarea obezității induse de dietă, steatoză hepatică, hiperlipidemie și rezistență la insulină. Am stabilit că efectul benefic al deficitului de TAZ este direct legat de păstrarea nivelurilor hepatice de CL, a supercomplexelor mitocondriale și a funcției respiratorii. În cele din urmă, am identificat biosinteza hepatică crescută a FAO și CL ca mecanisme moleculare responsabile. Sugerăm că modificarea remodelării CL hepatice servește ca o opțiune terapeutică nouă pentru pacienții cu risc de diabet de tip 2.

Informații despre articol

Mulțumiri. Autorii îi mulțumesc Dr. Tooru Mizuno, Departamentul de Fiziologie, Universitatea din Manitoba, pentru utilizarea echipamentelor de calorimetrie indirectă.

Finanțarea. Această lucrare a fost susținută parțial de subvenții de la Fundația Heart and Stoke din Canada, Institutele Canadiene pentru Cercetare în Sănătate (CIHR), Fundația Sindromului Barth (către GMH), Institutele Naționale de Sănătate (grant R01HL108882 către SMC) și premii pentru stagiari din programul CIHR integrat și mentorat de formare pulmonară și cardiovasculară (la LKC) și Research Manitoba/Children's Hospital Research Institute of Manitoba (la EMM). G.M.H. este catedra de cercetare din Canada în metabolismul cardiolipinei moleculare.

Dualitatea interesului. Nu au fost raportate potențiale conflicte de interese relevante pentru acest articol.