A pentru prepararea tirozolului și/sau hidroxitirosolului din apele uzate ale fabricii de ulei. include: a) Microfiltrarea (MF), Ultrafiltrarea (UF), Nanofiltrarea (NF) și Osmoza inversă (RO) a OMW; b) Separarea tirozolului, hidroxitirosolului și a altor compuși fenolici de RO concentrat; c) Oxidarea tirozolului obținut în hidroxitirosol în prezența trioxidului de metil reniu și a peroxidului de hidrogen într-un solvent protic.

brevet

Prezenta invenție se referă la un proces de recuperare a tirozolului și hidroxitirosolului din apele uzate ale fabricii de ulei și o metodă de oxidare catalitică a tirozolului la hidroxitirosol.

CONTEXTUL INVENȚIEI

Este bine cunoscută problema apelor uzate ale fabricii de ulei. Măslinele presate în țările producătoare de ulei creează ca produs secundar, la o rată de 40/50% din greutatea măslinelor presate, ape uzate ale morii de ulei bogate în compuși organici foarte poluanți (polifenoli) care creează un număr de probleme legate de eliminarea și tratamentul acestora.

Multe metode au fost propuse pentru a elimina acest tip de problemă, de exemplu printr-o tehnică de catalizare foto, ozonizare etc., dar până în prezent nu există încă o soluție satisfăcătoare, în special o soluție care nu implică o contracție drastică a producției cu o creștere puternică a prețurilor.

Pe de altă parte, se știe că apele uzate ale fabricii de ulei conțin metaboliți de interes pentru industria cosmetică, farmaceutică, dietetică și alimentară. Izolarea acestor metaboliți, în special tirozol și hidroxitirosol, din apele uzate ale fabricii de ulei, este, prin urmare, un obiectiv de interes deosebit aplicat, datorită proprietăților lor antioxidante.

De exemplu, WO2004/005228 descrie un proces de extracție a hidroxitirosolului, cuprinzând acidificarea apelor uzate ale morii de ulei urmată de extracții cu solvenți organici și fluide supercritice.

DESCRIEREA INVENȚIEI

S-a găsit acum un proces de tratare a apelor uzate ale fabricii de ulei (OMW) care permite, pe de o parte, detoxifierea OMW cu o recuperare a apei de până la 85% pentru o utilizare bine udată și civilă, conform legii adoptate și, pe de altă parte, o recuperare a tirozolului și a hidroxitirozolului foarte pure.

În plus, această invenție oferă un proces pentru oxidarea catalitică ulterioară a tirozolului în hidroxitirosol.

Acest proces permite recuperarea fiecărei componente lichide de pornire, reutilizarea și exploatarea fiecărei componente separate.

Procedeul invenției este ușor de aplicat industrial, fără costuri suplimentare care influențează prețul de vânzare al uleiului de măsline și oferă posibilitatea comercializării produselor pe bază de hidroxitirosol, care pot fi utilizate pentru sănătatea umană (medicamente), pentru îngrijirea sănătății (integratori, nutraceutice), cosmetice) și pentru industriile alimentare.

Procedeul invenției include:

    • Filtrare dură (RF), Microfiltrare (MF), Ultrafiltrare (UF), Nanofiltrare (NF) și Osmoza inversă (RO) a OMW;
    • Separarea cromatografică a tirozolului, hidroxitirosolului și a altor compuși fenolici de RO concentrat;
    • Oxidarea tirozolului obținut în hidroxitirosol în prezența trioxidului de metil reniu și a peroxidului de hidrogen într-un solvent protic;
    • Concentrarea și pulverizarea porțiunii cu greutate moleculară mare cu recuperarea apei și a compușilor cu o valoare adăugată ridicată.

Etapele secvențiale de filtrare dură, microfiltrare, ultrafiltrare, nanofiltrare și osmoză inversă, schematizate în FIG. 1 care se referă la intervale specificate de dimensiune moleculară, permite recuperarea, după concentrare, de cel puțin 1 g/l de hidroxitirosol și 0,6 g/l de tirozol.

Aceste componente pot fi apoi izolate cu o puritate mai mare de 98% prin cromatografie în fază inversată pe o coloană pregătitoare.

Coloana pregătitoare este umplută de preferință cu un copolimer macroporos de divinilbenzen și N-vinilpirolidonă. Acest copolimer, datorită grupului funcțional polar, este capabil să rețină moleculele polare. Utilizarea coloanelor umplute cu acest copolimer permite izolarea componentelor (tirozol, hidroxitirosol, acid tri-hidroxibenzoic, catecol etc.) conținute în amestec și, în special, pentru a prepara hidroxitirosol cu ​​un nivel ridicat de puritate, fără catecol (orto -difenol conținut în OMW și toxic pentru om).

Raportul de concentrație (hrană/extract) în etapele de microfiltrare, ultrafiltrare, nanofiltrare și osmoză inversă este de preferință mai mare de 8.

Procesul de invenție permite recuperarea a cel puțin 70% din volumul de apă în ceea ce privește volumul total inițial al OMW, cu o astfel de calitate încât este posibil să se mențină în limitele definite de prezentele legi despre posibila utilizare agricolă/civilă mai mici de 100 mgO2/l de COD). De preferință, etapele Ultrafiltrării, Nanofiltrării și Osmozei Inverse sunt efectuate la pH neutru sau alcalin.

Un tratament suplimentar de evaporare/condensare pe concentratele diferitelor etape de filtrare permite recuperarea cu aproximativ 15% în continuare, până la o recuperare totală de 85% a apei.

Fracțiunea de material organic recuperată din etapele anterioare ale membranei înainte de osmoza inversată constă din compuși polifenolici distribuiți în diferite clase de greutate moleculară.

Polifenolii obținuți prin acest proces pot fi utilizați pentru preparatele cosmetice și farmaceutice pentru prevenirea stresului oxidativ pe membrana dermică, cum ar fi anti-îmbătrânire, dar și pentru estomparea pielii ca antagoniști ai procesului de melanogeneză.

În timp ce fracțiunile, care conțin amestecuri antioxidante de eliminare, elimină radicalii liberi conținuți în structura melaninei producând un efect de estompare a pielii, mecanismul de acțiune al tirozolului acționează concurând cu tirozina în procesul controlat de o enzimă numită tirozinază, care constituie doar o parte a procesul total al melanogenezei. De fapt, chiar și tirozolul este supus activității enzimatice a tirozinazei, modificându-se în hidroxitirosol conform schemei 1. Astfel, concurează cu tirozina în reacția enzimatică.

Prin urmare, tirozolul livrat straturilor derma mai profunde poate concura cu tirozina pentru tirozinaze, reducând cantitatea de dopamină disponibilă pentru a continua procesul de melanogeneză, reducând astfel colorarea dermică.

Diferitele fracții și compuși precum tirozol, hidroxitirosol etc., obținute prin procesul inovator descris aici, au fost utilizate pentru formularea preparatelor pentru utilizare topică pentru a se opune procesului de melanogeneză și a induce derma decolorarea și decupmentarea.

Utilizările polifenolilor nu se limitează la exemplele menționate, ci includ și prepararea de lacuri, adezivi și compozite.

Reacția de oxidare a tirozolului la hidroxitirosol poate avea loc în faza omogenă, eterogenă sau de tranziție, folosind apă și solvenți hidrocarbonati precum pentan, heptan și altele similare.

Catalizatorul trioxid de metilreniu (MTO) poate fi, de asemenea, utilizat într-o formă legată de matrici polimerice inerte, cum ar fi poli (4-vinilpiridina) și polistiren. În acest caz, catalizatorul eterogen utilizat pentru oxidare poate fi recuperat din sistemul de reacție prin simpla filtrare și reutilizat în cel puțin zece cicluri secvențiale de transformare fără pierderi vizibile de activitate și selectivitate.

Oricum, condițiile de cataliză omogenă sunt preferate pentru oxidare, folosind solvenți protici precum apă, alcooli C1-C3, acid acetic sau amestecuri ale acestora.

Procesul de oxidare conform invenției poate fi realizat în mod evident pe tirozol care nu derivă din metoda de tratare a apelor uzate ale morii de ulei, ci și din alte surse, de exemplu tirozol comercial de calitate tehnică.

Invenția va fi acum ilustrată în mai multe detalii în următoarele exemple.

EXEMPLUL 1 Tratamentul combinat al OMW prin proces de micro, nano, ultrafiltrare, osmoza inversă și tehnici de separare și recuperare

Fabrica pilot a fost furnizată de firma Hydro Air Research în conformitate cu proiectul solicitantului și constă din trei unități.

A doua unitate constă din 2 module pentru microfiltrare (MF; 120 000 D; 0,24 mp × 2).

S-au făcut mai multe teste modificând în principal raportul de concentrație dintre cel pătruns și cel extras. În etapa de osmoză inversă, este necesar să se stabilească raportul de concentrație dintre extract și cel pătruns. Temperatura exercițiului nu trebuie să depășească 80 ° C. Pentru funcționalitatea membranei, ci de preferință mai mică de 60 ° C. Pentru a proteja integritatea metaboliților.

Se poate observa că, conform procesului descris, dezvoltat de solicitant, extractul de osmoză conține mai mult de 1 g/l de hidroxitirosol și mai mult de 0,6 g/l de tirozol.

Cromatograma HPLC-MS a fracției de osmoză inversă, raportată în FIG. 2, arată zona vârfurilor mai mare de 1%.

Purificarea materiei prime obținute prin flash-cromatografie sau cromatografie pe copolimer divinilbenzen/N-vinilpirolidonă a permis izolarea:

    • Tirozol cu ​​randament mai mare de 84% (puritate> 80%);
    • Hidroxitirosol cu ​​randament mai mare de 80% (puritate> 80%).

Hidroxitirosolul și tirozolul astfel obținuți au fost aduși la puritate mai mare de 98% prin coloană HPLC semipreparativă în fază inversată ca, de exemplu, tipul C18 Zorbax® de la Agilent ™.

Produsele obținute prin purificare au fost pe deplin caracterizate prin tehnici spectroscopice (1H și 13C RMN, FT-IR) și spectrometrice (GC-MS, LC-MS) și dovezi de puritate mai mare de 98% (FIG. 3).

Fracțiile de concentrare obținute din diferitele etape de filtrare, așa cum s-a descris mai sus, au fost caracterizate prin măsurarea parametrilor macro-descriptivi cu metode spectroscopice și spectrometrice (FIG. 2).

EXEMPLUL 2 Oxidarea catalitică a tirozolului în hidroxitirosol în condiții omogene și eterogene

Au fost efectuate diferite reacții (Schema 2), iar rezultatele lor sunt reluate în Tabelul 3.

Cele mai bune rezultate s-au obținut cu MTO (10% din greutate comparativ cu substratul) care lucrează în EtOH la 20 ° C. și în H2O la 45 ° C.

Rezultatul oxidării în apă este deosebit de interesant, deoarece reacția este extrem de ecocompatibilă și are un impact redus asupra mediului.

Reacția a fost repetată chiar și în condițiile transferului de etapă folosind pentan, heptan și alți solvenți similari.

Pe lângă alte două tipuri de catalizatori eterogeni ai reniului, pe baza heterogenizării trioxidului de metilreniu (MTO) pe poli (4-vinilpiridină) și polistiren, conform literaturii (R. Saladino și colab., „Prepararea și caracterizarea structurală a polimerului -Sistemele trioxid de metilreniu acceptate ca catalizatori eficienți și selectivi pentru epoxidarea olefinelor ” J. Org. Chem., 2002, 67, 1323-1332).

i) Prepararea catalizatorilor polari (4-vinilpiridină)/MTO

S-au adăugat 77 mg (0,3 mmol) de MTO la o suspensie de rășină de 600 mg [poli (4-vinilpiridină) 2% sau 25% reticulat cu divinilbenzen] în 4 ml etanol și amestecul a fost agitat timp de aproximativ 1 oră folosind un agitator magnetic.

ii) Pregătirea catalizatorului microîncapsulat MTO

S-au adăugat 77 mg (0,3 mmol) de MTO la o suspensie de 600 mg de polistiren în 4 ml de tetrahidrofuran (THF) și amestecul a fost agitat timp de aproximativ 1 oră folosind un agitator magnetic. Amestecul de reacție a fost adăugat cu succes cu n-hexan și reziduul solid a fost filtrat și spălat cu acetat de etil. Chiar și în acest caz, MTO adăugat a fost complet legat de suport, confirmat de analiza spectroscopică a reziduului după evaporarea fazei organice utilizate pentru spălarea catalizatorului. Analiza prin microscop electronic cu scanare (SEM) arată formarea de microcapsule perfect sferice cu diametrul mediu de aproximativ 50 μm. Catalizatorul corespunzător, în care MTO este blocat fizic în microcapsulă, va fi denumit în continuare PS2M.

Reacții oxidative la tirozol

Toți catalizatorii eterogeni sunt utilizați pentru transformarea inovatoare a tirozolului în hidroxitirosol. Câteva exemple sunt descrise mai jos.

Reacțiile oxidative au fost efectuate folosind tirozol de la purificarea apelor uzate ale fabricii de ulei. Reacțiile au fost efectuate cu o concentrație de tirozol de 100 mg/ml în etanol la 40 ° C. Cu toți catalizatorii eterogeni descriși anterior, folosind un mic exces de peroxid de hidrogen (H2O2, 2 echivalenți) la 30% în soluție de apă ca oxidant primar. Inițial, un factor de încărcare (parametru de încărcare corespunzător mmol de MTO activ per gram de rășină) egal cu 0,5 (Schema 3) a fost ales pentru catalizatori.

Această valoare este deosebit de mică deoarece, în aplicații industriale, valorile factorului de încărcare între 1,0 și 10 sunt utilizate în mod normal. Reacțiile au fost efectuate timp de 24 de ore. La final, au fost tratați cu două metode alternative.

Metoda A: amestecul de reacție a fost diluat cu acetat de etil și s-a adăugat o cantitate catalitică de MnO2 pentru a distruge eventualul exces de oxidant. MnO2 a fost filtrat și solventul evaporat obținând o reacție brută conținând în principal tirozol (nereacționat) și hidroxitirosol.

Metoda B: (metoda acidului ascorbic): la sfârșitul reacției, amestecul a fost diluat cu 3 volume de metanol rece și s-a adăugat aceeași cantitate în greutate (ca la tirozolul primar) de acid ascorbic (vitamina C). După 15 minute, s-au adăugat 4 volume de apă, care conțin un procent ridicat de acid ascorbic, identic cu cel precedent. Agitarea trebuie continuată timp de 30 de minute și apoi trebuie efectuate extracții repetate cu acetat de etil. După o noapte în frigider, fazele organice combinate au fost stabile în conținutul de hidroxitirosol, chiar fără a fi separate de apa reziduală cu sulfat de sodiu. Metoda B este mai eficientă și a fost utilizată pentru a continua experimentarea. Produsele brute de reacție au fost purificate prin flash-cromatografie pe silice, utilizând amestecul de acetat de etil/n-hexan sau pe silicat de magneziu absorbant Florisil®. În acest din urmă caz, adsorbantul Florisil® a fost utilizat cu o încărcare de 5% (exemplu: pentru 1 g de amestec pentru a separa sunt necesare 20 g de Florisil®, care sunt de aproximativ 40 ml numit Bed Volume - BV) coloana atât de caracterizată:

Debit = BV/2 ml/min sau mai mult

Amestecul hidroxitirosol/tirozol a fost dispersat în 4 BV dintr-un amestec 1: 1 eter/hexan. Coloana a fost eluată cu maximum 20 BV din același amestec, extragând complet tirozolul pur din amestecul coloanei. Coloana a fost eluată cu maximum 15 BV de eter, care extrag hidroxitirosol pur conținut în coloană. Rezultatele acestei experimentări sunt prezentate în FIG. 4 .

EXEMPLUL 3 Utilizarea aplicativă a unuia dintre compușii purificați și/sau semi-sintetizați (hidroxitirosol) obținut prin procesul descris

Hidroxitirosolul, obținut prin procesul inovator descris aici, a fost utilizat pe culturi de celule endoteliale obținute din endoteliul venelor ombilicale umane (HUVEC) prelevate și depozitate așa cum este descris de Carluccio și colegii săi [Carluccio M. A. și colab. „Uleiul de măsline și polifenolii antioxidanți ai vinului roșu inhibă activarea endotelială: proprietăți antiaterogene ale fitochimicilor din dieta mediteraneană”; Arterioscleroză. Tromb. Vasc. Biol. 23, 622-9 (2003)], și pe o linie celulară monocitară U937 obținută din colecția American Type Culture, cultivată în RPMI1640 conținând 10% FCS.

Pentru a evalua inhibarea creșterii celulare, proliferarea monocitelor HUVEC și U937 a fost urmată de numărarea celulelor vitale utilizând metoda de excludere a albastrului tripan și folosirea MTT [3- [4,5-dimetil (tiazol-2-il)] - 3,3difeniltetrazolium - bromură), așa cum este descris de Fabiani și colegii săi [Fabiani R., și colab.; „Chimioprevenția cancerului prin hidroxitirosol izolat din uleiul de măsline virgin prin stoparea ciclului celular G1 și apoptoză”; Euro. J. Cancer Prev. Aug; 11 (4): 351-8 (2002)].

Apoptoza a fost evaluată folosind kitul Annexin V-FITC (Sigma () conform instrucțiunilor și analizat de FACS. Culturile celulare (10 5/ml) au fost tratate cu hidroxitirosol, obținut prin procesul industrial menționat mai sus, timp de 48 de ore înainte de eseurile de apoptoză.

Hidroxitirosolul (0-100 μmoli/l) a fost studiat pentru efectele sale asupra creșterii celulare și inducerea apoptozei în celulele monocitare (U937), în HUVEC și în celulele endoteliale umane transformate (EVC 304).

La concentrația de 100 μmoli/l timp de 48 de ore, Hidroxitirosolul produs cu procesul industrial menționat mai sus inhibă complet proliferarea celulară în U937, dar la 30 μmoles/l se observă o inhibare a creșterii celulare de aproximativ 50%. La aceste concentrații nu există variații semnificative în proliferarea HUVEC și ECV304.

Din aceasta, se poate observa că, la concentrații in vivo, Hidroxitirosolul produs cu procesul industrial menționat mai sus inhibă proliferarea și induce apoptoza în celulele monocitice, dar nu și în cele endoteliale.

EXEMPLUL 4 Utilizarea aplicativă a unui compus purificat (hidroxitirosol) obținut prin procesul descris, în preparatele dermocosmetice și farmaceutice pentru depigmentarea și iluminarea pielii

Diferitele fracții și compuși Tirozol, Hidroxitirosol etc., obținuți prin procesul descris, au fost utilizați pentru formularea produselor de uz local pentru a se opune melanogenezei și pentru a induce iluminarea și depigmentarea dermului utilizatorului.

Câteva exemple de formulări sunt raportate mai jos:

Primele date obținute folosind aceste preparate sunt evidențiate în graficul următor și demonstrează că, după un tratament de 20 de zile, la 50% dintre subiecții tratați există o creștere a luminii pielii între 2 și 3% și o scădere a culorii de aproximativ 2,5%. După 60 de zile, 25% dintre subiecții tratați au evidențiat o creștere a luminii pielii cu aproximativ 6% și o scădere a culorii cu aproximativ 8%. FIG. 5 prezintă date despre preparat ca „loțiune” comparativ cu un placebo.

Nu s-a găsit nicio variație a parametrilor studiați pe piele după aplicarea formulării placebo pentru fiecare tratament de 60 de zile. Acest rezultat arată cum componentele formulării placebo nu au un efect pozitiv în reducerea pigmentării pielii.

EXEMPLUL 5 Utilizarea aplicativă a fracțiunilor obținute și a uneia dintre substanțele purificate (tirozol, hidroxitirosol etc.) conform procedeului descris pentru formulările nutritive și dietetice

Diferitele fracții și tirozol, hidroxitirosol etc., obținute prin procesul descris, au fost utilizate pentru formularea produsului nutraceutic și dietetic.

Mai jos sunt prezentate câteva exemple de formulări obținute: