Laboratoare de cercetare pentru afiliere pentru științe ale sănătății și tehnologii alimentare, KIRIN Company, Ltd., Yokohama, Kanagawa, Japonia

hamei

Laboratoare de cercetare pentru afiliere pentru științe ale sănătății și tehnologii alimentare, KIRIN Company, Ltd., Yokohama, Kanagawa, Japonia

Laboratoare de cercetare pentru afiliere pentru științe ale sănătății și tehnologii alimentare, KIRIN Company, Ltd., Yokohama, Kanagawa, Japonia

Laboratoare de cercetare pentru afiliere pentru științe ale sănătății și tehnologii alimentare, KIRIN Company, Ltd., Yokohama, Kanagawa, Japonia

Laboratoare de cercetare pentru afiliere pentru științe ale sănătății și tehnologii alimentare, KIRIN Company, Ltd., Yokohama, Kanagawa, Japonia

Adresa actuală: Laboratoare centrale pentru tehnologii cheie, KIRIN Company, Ltd., Yokohama, Kanagawa, Japonia

Laboratoare de cercetare pentru afiliere pentru științe ale sănătății și tehnologii alimentare, KIRIN Company, Ltd., Yokohama, Kanagawa, Japonia

Laboratoare de cercetare pentru afiliere pentru științe ale sănătății și tehnologii alimentare, KIRIN Company, Ltd., Yokohama, Kanagawa, Japonia

Afiliere ANBAS Corporation, Osaka, Japonia

  • Yumie Morimoto-Kobayashi,
  • Kazuaki Ohara,
  • Chika Takahashi,
  • Sayoko Kitao,
  • Guanying Wang,
  • Yoshimasa Taniguchi,
  • Mikio Katayama,
  • Katsuya Nagai

Cifre

Abstract

Citare: Morimoto-Kobayashi Y, Ohara K, Takahashi C, Kitao S, Wang G, Taniguchi Y și colab. (2015) Componentele amare de hamei maturi induc termogeneza în țesutul adipos maro prin activitatea nervoasă simpatică. PLoS ONE 10 (6): e0131042. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0131042

Editor: Qinghua Sun, Universitatea de Stat din Ohio, STATELE UNITE

Primit: 25 septembrie 2014; Admis: 29 mai 2015; Publicat: 22 iunie 2015

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Compania Kirin, Ltd. și ANBAS Corporation au oferit sprijin sub formă de salarii pentru autorii YMK, KO, CT, SK, GW, YT, MK și KN, dar nu au avut niciun rol suplimentar în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. Rolurile specifice ale acestor autori sunt articulate în secțiunea „contribuțiile autorului”.

Interese concurente: YMK, KO, CT, SK, GW, YT și MK sunt angajați ai Kirin Company, Ltd. KN este președintele ANBAS Corporation. Nu există brevete, produse în curs de dezvoltare sau produse comercializate de declarat. Acest lucru nu modifică aderarea autorilor la toate politicile PLOS ONE privind schimbul de date și materiale.

Introducere

Sindromul metabolic, care este strâns legat de ateroscleroză, este acum recunoscut ca o problemă majoră de sănătate publică la nivel mondial [1]. Obezitatea este asociată cu rezistența la insulină, hiperlipidemie și hipertensiune și este un simptom major al sindromului metabolic [2]. Deoarece aportul excesiv de energie este o cauză cheie a obezității, modificarea adecvată a dietei și creșterea cheltuielilor de energie sunt abordări terapeutice evidente [3].

BAT este un organ major pentru termogeneza adaptivă indusă de frig și dietă [4,5]. Proteinele de decuplare (UCP) pot despărți respirația de sinteza ATP prin scurtcircuitarea fluxului interior al protonilor peste membrana mitocondrială internă. Deși UCP1, UCP2 și UCP3 sunt toate exprimate în BAT, UCP1 este considerat a fi regulatorul cheie al termogenezei adaptive în acest țesut [6]. Astfel UCP1 contribuie la menținerea greutății corporale, ajutând la controlul cheltuielilor de energie. BAT a fost recunoscută mult timp ca fiind abundentă la rozătoarele mici, dar absentă sau neglijabilă la omul adult. Cu toate acestea, studii recente, care utilizează fluorodeoxiglucoză (FDG) -PET în combinație cu tomografie computerizată (CT) [7], au arătat că oamenii adulți au BAT active din punct de vedere metabolic. De la publicarea acestor constatări, s-au depus eforturi considerabile pentru înțelegerea reglementării activității BAT cu scopul de a gestiona obezitatea și tulburările metabolice conexe.

Efectele fiziologice ale componentelor amare la hameiul oxidat nu au fost raportate. Aici, am pregătit componente amare din hamei oxidați, și anume componente amare amărui de hamei (MHB) și apoi am evaluat efectele MHB asupra acumulării de grăsime corporală. Mai mult, a fost investigat mecanismul de bază.

Materiale și metode

Materiale și substanțe chimice

Peletele de hamei și extractul de hamei izomerizat (ca standarde pentru izo-α-acizi) au fost achiziționate de la HopSteiner (Mainburg, Germania). Triciclooxiisohumulonele A și B au fost preparate așa cum este descris [14]. Ca standarde ale acizilor α și β, ICE2 a fost achiziționat de la Societatea Americană a Chimiștilor Brewing (St. Paul, MN).

Pregătirea și analiza HPLC a MHB

MHB a fost preparat așa cum s-a descris anterior din pelete de hamei [15]. MHB a fost analizat și cuantificat prin HPLC folosind o metodă raportată anterior [14,15].

Spectrele de masă de înaltă rezoluție ale componentelor MHB au fost măsurate folosind un spectrometru de masă Thermo Scientific LTQ Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA).

Animale

Administrarea unui HFD suplimentat cu MHB la șoareci

Analiza plasmatică la șoareci hrăniți cu HFD

Nivelurile de triacilglicerol plasmatic (TG), colesterol total, acid gras neesterificat (NEFA) și glucoză au fost măsurate folosind testul Triglyceride G Wako, testul colesterolului E Wako, testul NEFA C Wako și testul glucozei C Wako (Wako Pure Chemicals), Osaka, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului.

Măsurarea conținutului de lipide fecale la șoareci hrăniți cu HFD

Fecalele din cuștile în care au fost adăpostiți șoareci au fost colectate de două ori în timpul săptămânii a opta a experimentului. După uscare prin congelare, conținutul total de lipide din fecale a fost extras în cloroform: metanol (2: 1, v/v), așa cum s-a descris anterior [21]. Cantitatea de fracție lipidică extrasă a fost măsurată gravimetric, urmată de scăderea cantității de MHB din acea fracție. Cantitatea de MHB a fost măsurată prin metoda descrisă mai sus.

PCR cantitativă în timp real în țesuturile șoarecilor hrăniți cu HFD

ARN-ul total a fost extras din țesuturile șoarecilor cu Isogen (Nippon Gene, Toyama, Japonia) și purificat folosind RNeasy (Qiagen, Hilden, Germania) conform instrucțiunilor producătorului. ADNc a fost sintetizat din ARN total prin transcriere inversă utilizând sistemul ThermoScript RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). PCR cantitativă în timp real a fost efectuată cu un instrument LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Tokyo, Japonia) folosind SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio, Shiga, Japonia). Nivelurile de ARNm au fost normalizate la cel al ARNm gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenazei (GAPDH). Exemple de secvențe pentru UCP1, receptor activat cu proliferator peroxizom gamma coactivator-1α (PGC-1α), carnitin palmitoyltransferase 1β (CPT1β), acil-CoA oxidază (ACO), domeniu PR conținând 16 (PRDM16), receptor activat cu proliferator peroxizom PPARγ), receptorul ficatului X α (LXRα), proteina de legare a elementelor de reglare a sterolului-1c (SREBP-1c), acetil-CoA carboxilaza 1 (ACC1), acidul gras sintaza (FAS), acil-CoA dehidrogenaza cu lanț mediu (MCAD)), UCP3 și GAPDH sunt furnizate în tabelul S1.

Analiza imuno-blot a UCP1 în BAT la șoareci hrăniți cu HFD

Fracția mitocondrială a fost preparată folosind trusa de izolare a mitocondriilor (Biochain, Newark, CA) conform instrucțiunilor producătorului. Conținutul de proteine ​​mitocondriale a fost măsurat cu un kit de testare a proteinelor DC (Bio-Rad, Hercules, CA). Albumina serică bovină a fost utilizată pentru a genera o curbă standard. Fracția mitocondrială (2,5 μg) izolată din BAT la fiecare șoarece a fost separată prin SDS-PAGE. Anticorp policlonal de iepure anti-UCP1 (1: 2000, Calbiochem, Darmstadt, Germania) și anticorp policlonal de iepure anti-ubiquinol-citocrom C reductază 1 (UQCRC1) (1: 2000, Abcam Plc., Cambridge, Marea Britanie) au fost folosiți ca anticorpi primari și IgG anti-iepure, anticorp întreg legat de HRP (1: 20000, GE Healthcare Life Science, Amersham, Marea Britanie) ca anticorp secundar. Reactivitatea anticorpilor a fost detectată de reactivul ECL Prime Western Blotting Detection (GE Healthcare Life Science). Densitatea benzii de proteine ​​UCP1 a fost cuantificată prin analiză densitometrică și de imagine și normalizată la cea a benzii UQCRC1 ca standard intern prin utilizarea LAS-4000 (Fujifilm, Tokyo, Japonia). Datele au fost prezentate ca valoare relativă la grupul de control.

Înregistrarea BAT-SNA la șobolani având o singură administrare orală de MHB

BAT-SNA a fost determinat așa cum s-a descris anterior [22,23]. Pe scurt, după 3 ore de post, șobolanii masculi Wistar de 9 săptămâni au fost anesteziați cu uretan (1 g/kg, i.p.). Pentru administrarea orală a soluției de MHB (2 mg/kg sau 10 mg/kg), o canulă orală a fost introdusă în cavitatea gastrică (n = 3 șobolani/grup). După canulație traheală și lapatomie, capetele distale ale nervilor simpatici care inervează BAT interscapulară au fost expuse, ligate și ulterior conectate cu o pereche de electrozi din sârmă de argint. Temperatura corpului a fost menținută la 35,0 ± 0,5 ° C folosind un tampon termic. După stabilizarea timp de 30-60 min, semnalele electrice de la electrozi au fost colectate, amplificate, filtrate și monitorizate pe un osciloscop. Activitatea nervoasă a fost analizată prin conversia datelor brute în impulsuri standard, utilizând un discriminator de fereastră. La subgrupuri de șobolani, vagotomia subdiafragmatică a fost efectuată înainte de înregistrarea BAT-SNA. Chirurgia de rușine a fost efectuată în același mod, dar fără tăierea nervului vag. MHB a fost dizolvat în carbonat de potasiu 3,6 mM și administrat în cavitatea gastrică a șobolanilor folosind canula orală. Pentru grupul de control, șobolanilor li s-a administrat vehicul în care pH-ul a fost ajustat la aceeași valoare ca cea a soluției de MHB (pH 7) folosind HCI 1 N.

Măsurarea nivelului AMPc în BAT la șobolani, având o singură administrare orală de MHB

După 3 ore de post, șobolani Wistar masculi de 9 săptămâni au fost pretratați cu antagonistul β-adrenergic propranolol (Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO) (10 mg/kg, ip) sau ser fiziologic pentru a investiga implicarea receptorul β-adrenergic. La 30 de minute după pretratament, șobolanilor li s-a administrat oral soluție de MHB (10 mg/kg) printr-un tub stomacal (n = 10 șobolani/grup). Ca grup de control, șobolanilor li s-a administrat vehicul cu pH-ul ajustat la aceeași valoare ca cea a soluției de MHB (pH 7) folosind HCI 1 N. Șobolanii au fost uciși la 3 ore după administrarea MHB prin exsanguinare din aorta abdominală sub anestezie cu dietil eter, iar BAT interscapulară a fost apoi îndepărtată. Pentru pregătirea lizatelor BAT și măsurarea nivelului de cAMP în lizat, am folosit DetectX High Sensitivity Direct cAMP Chemiluminescent Immunoassay Kit (Arbor Assays, Ann Arbor, MI) urmând instrucțiunile producătorului. În fiecare caz, nivelul AMPc este prezentat ca raportul AMPc la proteină.

Măsurarea temperaturii BAT (TBAT) la șobolani având o singură administrare orală de MHB

Cu opt zile înainte de măsurarea TBAT, un transmițător de temperatură (TA11TA-F10, Data Sciences International (DSI), St. Paul, MN) a fost introdus între un tampon interscapular BAT și mușchiul trapez, iar incizia a fost suturată cu fir de mătase sub anestezie prin inhalare a izofluranului (Escain, Mylan Japonia, Tokyo, Japonia). Semnalul de ieșire a fost procesat folosind un receptor (RPC-1, DSI), o matrice de schimb de date și un monitor de referință a presiunii ambientale (APR-1, DSI). Datele obținute de acest sistem au fost analizate de sistemul de achiziție Dataquest ART 4.0 (DSI). În ziua experimentală, șobolanii masculi Wistar în vârstă de 9 săptămâni au fost anesteziați cu uretan (1,5 g/kg, i.p.) după post de 3 ore (n = 4 șobolani/grup). Pentru administrarea orală a soluției de MHB (10 mg/kg), o canulă orală a fost introdusă în cavitatea gastrică. Șobolanii au fost așezați pe tampoane de încălzire la temperatură fixă ​​(34 ° C) în timpul experimentelor. După administrarea MHB, TBAT a fost măsurat pentru o perioadă de 3 ore. Ca grup de control, șobolanilor li s-a administrat vehicul cu pH-ul ajustat la aceeași valoare ca cea a soluției de MHB (pH 7) folosind HCI 1 N.

analize statistice

Toate valorile sunt medii ± SEM. Diferențele statistice au fost analizate prin metodele statistice adecvate specificate în legendele din figura de mai jos. Valorile P Fig 1. MHB a îmbunătățit acumularea de grăsime corporală indusă de HFD la șoareci.

(A) Creșterea în greutate corporală a șoarecilor hrăniți cu HFD cu sau fără supliment de MHB. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM. n = 12 șoareci/grup. ** P Tabelul 1. Aportul total de alimente la șoareci hrăniți cu HFD cu sau fără supliment de MHB și efectul MHB asupra conținutului de lipide fecale.

MHB a indus o creștere a nivelurilor de ARNm ale genelor legate de termogeneză și oxidarea acizilor grași la BAT la șoareci

Pentru a elucida mecanismele care stau la baza efectelor MHB, RT-PCR cantitativă a fost efectuată folosind țesuturi de la șoareci după hrănirea de 9 săptămâni a MHB. Suplimentarea cu MHB a crescut semnificativ nivelurile de ARNm ale genelor PGC-1α, UCP1, CPT1β și ACO cu 1,6 ori, 1,2 ori, 1,3 ori, respectiv 1,2 ori în BAT, (Fig 2A). Nivelurile de ARNm ale PRDM16 și PPARy au fost, de asemenea, crescute semnificativ prin hrănirea MHB. A existat, de asemenea, o creștere concomitentă a nivelului de proteină UCP1 în mitocondriile BAT izolate de la șoareci hrăniți cu MHB (de 1,3 ori, P Fig 2. Măsurarea nivelurilor de expresie a ARNm și analiza imuno-blot în BAT interscapulară a șoarecilor hrăniți cu HFD suplimentat cu MHB.

(A) nivelurile de expresie a ARNm în BAT. Nivelurile de expresie ale ARNm au fost normalizate la nivelul de expresie al GAPDH ca referință. (B) Analiza imuno-blot a UCP1 în mitocondriile BAT. Imuno-pete reprezentative sunt prezentate pe histogramă. Semnalele reprezentative prezentate provin din aceeași membrană imuno-blot. Nivelul proteinei UCP1 a fost normalizat la nivelul proteinei UQCRC1 ca referință. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM. n = 12 șoareci/grup. * P Fig 3. Administrarea orală unică de BAT-SNA crescut cu MHB la șobolani.

(A) Cursul de timp al modificărilor BAT-SNA luate la fiecare 5 minute și media BAT-SNA pe o perioadă de la 0 la 90 de minute. Șobolanilor anesteziați cu uretan li s-au administrat 10 mg/kg de MHB. Datele au fost calculate ca procent din valoarea inițială și ca medie ± SEM. n = 3 șobolani/grup. ** P Fig 4. Administrarea orală unică de MHB a crescut nivelul de AMPc în BAT și a crescut temperatura acestuia la șobolani.