Anthony M Belenchia

Departamentele 1 Nutriție și Fiziologie a exercițiilor și

Sarah A Johnson

2 Științe biomedicale și

3 Bond Life Sciences Center, Universitatea din Missouri, Columbia, Missouri

Alyssa C Kieschnick

Departamentele 1 Nutriție și Fiziologie a exercițiilor și

Cheryl S Rosenfeld

2 Științe biomedicale și

3 Bond Life Sciences Center, Universitatea din Missouri, Columbia, Missouri

Catherine A Peterson

Departamentele 1 Nutriție și Fiziologie a exercițiilor și

Abstract

curs

Numărul de articole, inclusiv cuvintele cheie „deficit de vitamina D”, „rozătoare” și „modele animale”.

Studiile VDD la animale, inclusiv femelele în vârstă de reproducere, trebuie să acomodeze perioada de latență caracteristică vitaminelor liposolubile din dietă, cum ar fi vitamina D, și să asigure timpul de expunere necesar, pentru a recapitula efectele fenotipice observate la populațiile umane VDD. În schimb, s-ar putea să apară complicații sistemice secundare datorate VDD pe termen lung și să confunde rezultatele experimentale. Din aceste motive, cursul de timp și răspunsul la 25-hidroxivitamină D (25 (OH) D) (cel mai bun indicator general acceptat al stării de vitamina D) la dietele VDS și VDD în rozătoarele de laborator justifică investigația, în special în cele mai utilizate și frecvent utilizate tulpina de șoarece pentru cercetarea metabolică, șoareci C57BL/6 („negri 6”). 21 Prin urmare, obiectivele noastre actuale au fost: 1) să caracterizeze cursul de timp al inducției și repletiei VDD la șoarecii C57BL/6 femele de vârstă reproductivă și 2) să exploreze consecințele pe termen lung ale VDD, în special în ceea ce privește compoziția corpului, o indicator al sănătății metabolice.

Materiale și metode

Animale și diete.

Ambele experimente au fost aprobate și efectuate în conformitate cu Universitatea din Missouri IACUC (protocolul 7753). Toate procedurile au urmat Ghidurile NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. 34 Toate experimentele au fost efectuate ca lucrări preliminare pentru un studiu mai amplu care examinează efectele DOHaD ale VDD materne în timpul sarcinii asupra sănătății metabolice pe termen lung a descendenților. Șoarecii C57BL/6J femele (vârsta, 8 săptămâni) au fost achiziționați de la Jackson Labs (Jackson Labs; Bar Harbor, ME). Pentru a determina o cronologie eficientă pentru inducerea și inversarea VDD, serul a fost colectat de la șoareci C57BL/6 femele mature de 8 săptămâni, care apoi au fost randomizate pentru a primi fie o vitamină D suficientă (VDS; AIN-93G, D10012G, Research Diets, New Brunswick, NJ) sau VDD (AIN-93G modificat; D1007301, Research Diets) dieta (Figura 2). În afară de vitamina D, toți nutrienții, inclusiv calciu și fosfor, au fost furnizați în cantități care îndeplinesc cerințele nutrienților NRC pentru animalele de laborator. 51 Șoarecii aveau acces gratuit la diete și apă. În timpul experimentului de expunere pe termen scurt, aportul de furaje a fost măsurat prin cântărirea zilnică a alimentelor timp de 5 zile consecutive în timpul săptămânilor 1 și 8. Greutatea corporală a fost măsurată la momentul inițial și la fiecare 2 săptămâni pe parcursul ambelor experimente.

Compoziția nutrienților și densitatea energetică a dietelor experimentale.

Expunere VDD pe termen scurt.

Serul a fost colectat la momentul inițial și săptămânal timp de 4 săptămâni (săptămâni 1 până la 4) pentru determinarea concentrațiilor de 25 (OH) D, hormon paratiroidian (PTH) și concentrații de calciu. Imediat după colectarea săptămânii 4, șoarecii VDD au fost trecuți la o dietă VDS, iar serul a fost colectat în mod similar pentru 4 săptămâni ulterioare (săptămânile 5-8) pentru determinarea concentrațiilor de 25 (OH) D, PTH și calciu.

Expunere VDD pe termen lung.

În studiul pe termen lung, greutatea corporală a fost măsurată și serul colectat la momentul inițial și la fiecare 2 săptămâni după aceea. Compoziția corpului cu trei compartimente (țesut slab, țesut adipos și apă) a fost determinată prin utilizarea echoMRI în săptămâna 40 de hrănire (48 săptămâni de vârstă), chiar înainte de terminarea studiului.

Determinarea concentrațiilor serice de vitamina D, calciu și PTH.

Sângele întreg a fost colectat din vena safenă și distribuit în tuburi de separare a serului (nr. Catalog 201308, Sarstedt, Numbrecht, Germania), centrifugat conform instrucțiunilor producătorilor și depozitat la –80 ° C. Datorită volumelor limitate de ser care ar putea fi colectate în fiecare moment, am alternat parametrii care au fost măsurați. Concentrațiile serice circulante de 25 (OH) D au fost determinate prin ELISA (interval de detecție, 10 până la 300 nmol/L; coeficient de variație intra-test, 4,2%; nr. Catalog VID21-K02, Eagle Biosciences; Nashua, NH). Concentrațiile serice de calciu au fost determinate prin test colorimetric (Sigma-Aldrich; St Louis, MO). Concentrațiile serice de PTH au fost determinate prin imunoanaliză enzimatică (interval de detecție, 1,47 până la 1000 pg/ml; coeficient de variație intra-test, 10%; Sigma - Aldrich).

analize statistice.

Comparațiile de bază ale greutății corpului întreg, concentrațiile de 25 (OH) D și aportul zilnic de furaje au fost analizate folosind testul Student t. Între și în cadrul grupului dietetic, comparațiile dintre concentrațiile circulante de 25 (OH) D și greutatea corporală au fost efectuate utilizând ANOVA cu măsuri repetate. Dieta, timpul și interacțiunea dietă × timp au servit ca variabile independente pentru analize, permițându-ne să stabilim dacă efectul dietei (efectul principal; pentru orice rezultat dat) a fost dependent de cât timp au fost șoarecii în dietă. În acest model, timpul a fost o măsură repetată, făcând astfel posibilă compararea grupurilor de tratament în fiecare moment. Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM. Toate analizele au fost făcute utilizând software-ul statistic SAS 9.4 (SAS Software, Cary, NC); o valoare P de 0,05 sau mai puțin a fost considerată semnificativă.

Rezultate

Depleția și reumplerea vitaminei D la șoareci femele de vârstă reproductivă.

La momentul inițial, nici greutatea corporală, nici starea vitaminei D nu au diferit între grupurile VDS și VDD (19,3 ± 1,3 g comparativ cu 18,8 ± 1,4 g, P = 0,774; Tabelul 1). De asemenea, consumul zilnic de furaje a fost similar între grupurile VDS și VDD în timpul săptămânii 1 (2,6 ± 0,2 g comparativ cu 2,7 ± 0,2 g, P = 0,73) și săptămâna 8 (2,9 ± 0,3 g comparativ cu 3,0 ± 0,2 g, P = 0,748; Tabelul 1). Concentrațiile serice 25 (OH) D au prezentat o semnificativă (P Figura 3 A), dar modificarea săptămânală a concentrației serice 25 (OH) D a fost semnificativă numai între săptămânile 2 și 3 ale dietei VDD (scădere cu 28,2 nmol/L, P = 0,009). Mai mult, diferența dintre grupuri în concentrația de 25 (OH) D nu a fost semnificativă până în săptămâna 2 (53,4 ± 11,4 nmol/L comparativ cu 79 ± 11,2 nmol/L, P = 0,014). În ciuda concentrațiilor semnificativ mai mici de 25 (OH) D decât grupul VDS, șoarecii VDD nu au fost VDD în conformitate cu limita stabilită de Institutul de Medicină (adică 25 (OH) D mai puțin de 50 nmol/L) până la săptămână 3. Concentrațiile circulante de 25 (OH) D au început să se niveleze în grupul VDD, cu o scădere nesemnificativă între săptămânile 3 și 4 (scădere de 7,5 nmol/L, P = 0,782). 60

tabelul 1.

Greutatea corporală inițială, concentrația de 25 (OH) D și aportul mediu de alimente

VDSVDDP
Greutatea întregului corp (g)19,3 ± 1,318,8 ± 1,40,774
25 (OH) D (nmol/L)73,5 ± 11,572,0 ± 10,80,904
Aportul zilnic mediu (săpt. 1; g)2,6 ± 0,22,7 ± 0,20,730
Aportul zilnic mediu (săptămâna 8; g)2,9 ± 0,33,0 ± 0,20,748

VDD, deficit de vitamina D; VDS, suficientă cu vitamina D

Datele sunt date ca mijloace ± SEM. Valorile P reprezintă compararea grupurilor dietetice utilizând testul Student t.

Starea vitaminei D la șoarecii femele în vârstă de reproducere expuși pe termen lung la VDD.

Concentrațiile serice 25 (OH) D la momentul inițial nu au diferit între grupurile VDS și VDD (73,5 ± 11,3 nmol/L comparativ cu 71,4 ± 11,4 nmol/L, P = 0,896; Figura 4 A). Concentrațiile serice 25 (OH) D au arătat semnificative (P Figura 4 B). Nivelurile serice de PTH din grupul VDS nu s-au modificat pe tot parcursul studiului (P = 0,963). În grupul cu VDD, PTH seric a fost semnificativ mai mare decât în ​​grupul cu VDS începând cu 2 săptămâni (66,2 ± 23,2 pg/mL comparativ cu 131,2 ± 24,4, P = 0,024; Figura 4 B) și a rămas semnificativ mai mare la fiecare moment ulterior puncte. În cadrul grupului VDD, PTH seric a crescut semnificativ între săptămânile 2 și 6 (creștere de 50,3 pg/ml, P = 0,044); nu au existat alte creșteri semnificative între săptămâni pentru restul studiului.

Concentrațiile serice de calciu au arătat o interacțiune semnificativă (P = 0,041) între dietă și timp (Figura 4 C). Deși niciunul dintre grupuri nu a prezentat modificări semnificative săptămânal-săptămânal în concentrația serică de calciu, aceste niveluri au fost mai mici la șoarecii hrăniți cu VDD decât la șoarecii VDS începând cu săptămâna 12 și durând pe tot parcursul experimentului.

Curba de creștere și compoziția corpului șoarecilor femele în vârstă de reproducere expuși pe termen lung la VDD.

Serul 25 (OH) D, derivatul hidroxi al vitaminei D și un indicator funcțional al stării vitaminei D, are un timp de înjumătățire raportat de aproximativ 20 până la 30 zile la om; Observația noastră conform căreia au fost necesare 3 săptămâni pentru concentrații de 25 (OH) D (în scădere cu aproximativ 2 nmol/L zilnic) pentru a ajunge la o stare deficitară la șoareci femele de vârstă reproductivă este în concordanță cu acest raport. Rezultatele noastre evidențiază, de asemenea, importanța unor studii bine concepute care nu numai că asigură suficient timp pentru epuizarea vitaminei D, dar iau în considerare și posibilitatea unei concentrații serice 25 (OH) D neschimbate, scăzute, dar stabile pe o perioadă lungă de timp. Datele noastre despre homeostazia calciului aruncă o lumină în acest sens.

Pentru a ocoli complicațiile de sănătate asociate cu consecințele calciotrope ale VDD, ar trebui luată în considerare utilizarea dietelor bogate în calciu. Este o practică obișnuită pentru anchetatorii care folosesc eliminarea receptorilor de vitamina D și modelele de șoareci lipsite de CYP27B1 (o enzimă necesară activării vitaminei D) folosind „diete de salvare” care mențin concentrații normale de calciu circulante. 19,36,46 Aceste diete de salvare sunt întărite cu calciu (aproximativ 2%) și fosfor (aproximativ 1,25%) și conțin lactoză suplimentară pentru a favoriza absorbția calciului. 17.39 Anchetatorii care utilizează un model VDD indus de dietă ar trebui să includă o dietă de salvare pentru a preveni confuzia rezultatelor.

În studiul actual, șoarecii reproductivi cu vârste întreținute pe o dietă VDD au demonstrat modele de creștere similare cu șoarecii hrăniți cu VDS până la 26 săptămâni, după care șoarecii VDD au început să piardă rapid în greutate. La încheierea studiului (40 săptămâni de dietă; 48 săptămâni de vârstă), șoarecii hrăniți cu VDD cântăreau semnificativ mai puțin decât șoarecii VDS. Măsurarea EchoMRI a compoziției corpului (grăsime comparativ cu compartimentele de masă corporală slabă) a indicat faptul că diferența de greutate corporală a fost atribuită pierderilor pe scară largă atât a țesutului slab, cât și a țesutului adipos. Acest rezultat nu este surprinzător, având în vedere că nivelurile serice de calciu au scăzut sub 2,0 mmol/L pentru o perioadă extinsă de timp. Poate că pierderea de masă observată s-a datorat dereglării sistemice și efectelor anorexigenice asociate cu hipocalcemia; 22 această ipoteză necesită un studiu suplimentar care include un grup de testare care primește o dietă de salvare a calciului. Alternativ, orice efect anorexigenic speculat ar putea fi atribuit perturbărilor hormonale, cum ar fi leptina, neuropeptida Y sau orexina; această întrebare ar trebui abordată în studiile viitoare. În plus, investigațiile de urmărire ar putea include scanări cu absorptiometrie cu raze X cu energie duală pentru a confirma cât de mult din diferența de masă slabă se datorează mineralelor osoase în comparație cu pierderea musculară.

O limitare majoră a ambelor experimente a fost incapacitatea de a măsura toți analiții în același timp, din cauza constrângerilor asupra cantității de ser care ar putea fi colectată în siguranță de la șoareci. În studiul pe termen lung, principala limitare a fost lipsa datelor privind consumul de alimente. Fără aceste informații, nu suntem în măsură să excludem consecințele anorexigenice ale VDD, ceea ce ar explica pierderea dramatică în greutate la șoarecii VDD, așa cum s-a documentat în unele studii VDD umane. 4.65 Studiile viitoare care alimentează dietele VDD pe termen lung ar trebui să examineze aportul total de furaje și să controleze efectele potențiale asupra greutății corporale. Singurul alt studiu cunoscut care a examinat efectele pe termen lung ale VDD la șoarecii C57BL/6 nu au măsurat, de asemenea, aportul de alimente. 69

Consecințele bine înțelese ale VDD la animalele de laborator, pe care se bazează recomandările actuale ale NRC, sunt hipocalcemia și hiperparatiroidismul. 51 Cu toate acestea, de la cea mai recentă publicare a recomandărilor NRC din 1995, am ajuns să înțelegem că vitamina D joacă multe roluri în organism și că sunt necesare modele animale care recapitulează condițiile legate de VDD. 32 Aici am caracterizat evoluția timpului atât a epuizării VDD cât și a repletiei la șoareci femele de vârstă reproductivă. Aceste date îi vor ajuta pe anchetatori în proiectarea lucrărilor viitoare, inclusiv studii care examinează potențialul efectelor DOHaD ale descendenților provenind de la VDD matern. Rezultatele noastre evidențiază în plus importanța monitorizării și controlului efectelor calciotrope ale VDD induse de dietă atunci când studiați efectele noncalciotrope și susținerea utilizării dietelor de salvare hipocalcemice în studiile de dietă VDD pe termen lung. Mai mult, oferim dovezi la șoareci femele C57BL/6 de vârstă reproductivă că VDD pe termen lung are ca rezultat modificări semnificative din punct de vedere metabolic în compoziția corporală absolută, dar nu relativă (reducere cu 21% a grăsimii corporale și pierderea cu 13% a masei slabe). Aceste efecte ar putea fi o considerație importantă în studiile privind vitamina D și sănătatea metabolică. 42,57

Mulțumiri

Această lucrare a fost finanțată de Universitatea din Missouri, Departamentul de Nutriție și Fiziologie a Exercițiului.