Abstract

Incidența diabetului de tip 2 și a obezității crește rapid la nivel mondial (1). În prezent, insensibilitatea generalizată la insulină este considerată evenimentul patogen central (2) care este frecvent legat de un sindrom metabolic sistemic, o stare de inflamație cronică la nivel scăzut care implică activarea macrofagelor în țesutul adipos (3). Înțelegerile recente indică, de asemenea, factori genetici în dezvoltarea bolii (4). Cu toate acestea, hiperglicemia cronică induce modificări macro și microvasculare extinse (5) care duc la afectarea sistemică a organelor. Vasele mari reacționează la creșterea cronică a glucozei și a metaboliților conduși de glucoză cu arterioscleroză îmbunătățită. Microangiopatia diabetică evocă treptat retinopatia, ducând la orbire ulterioară și nefropatie, cea mai frecventă cauză a insuficienței renale. În piele, microvasculopatia provoacă inflamații prelungite, afectarea vindecării rănilor și ulcere (6).

vaselor

În acest articol, raportăm despre creșterea densității limfatice a microvaselului la nivelul pielii pacienților cu diabet zaharat de tip 2. Prin compararea profilurilor de expresie genică ale celulelor endoteliale limfatice cutanate proaspăt izolate (LEC) de la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 cu cele ale controalelor normoglicemice, am identificat procesele moleculare și celulare reglementate în vasele limfatice, în special, transferul lipidic proinflamator, limfangiogen și îmbunătățit. proprietăți, însoțite de apărare imunitară reglementată în jos, mediatori de apoptoză și transportori compuși mici. Concomitent, am urmărit o infiltrare puternică de macrofage CD68 + dermică, care a determinat niveluri crescute ale factorului de necroză tumorală-α (TNF-α). Un subset de gene dereglate LEC (dLEC) diabetice a fost receptiv la TNF-α și corelat cu remodelarea și inflamația vaselor limfatice, inclusiv chemokina CXCL10, care a dus în mod specific la atracția și aderarea macrofagelor la LECs in vitro. Prin urmare, am obținut primele indicații pentru a cunoaște că sistemul limfatic dermic este implicat activ în progresia manifestărilor cutanate în diabetul de tip 2.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Probele de piele de la pacienții cu diabet zaharat și fără diabet de tip 2.

Studiul a fost aprobat de comitetul local de etică (propunerea nr. 449/2001; 81/2008) și toți pacienții (descriși în tabelul suplimentar 1) au dat consimțământul informat. Probele de piele (n = 4 în fiecare grup) au fost luate din regiunea proximală a picioarelor amputate sau a țesutului abdominoplastic și s-a avut grijă să se excizeze zonele la distanță maximă de modificările inflamatorii sau ulcerate (~ 15 cm).

Analize imunohistochimice.

Colorările imunohistochimice ale secțiunilor de piele încorporate în parafină sau criofixate au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (10). Tabelul suplimentar 2 rezumă anticorpii și diluțiile respective aplicate. Pentru cuantificări, sub excluderea zonelor goale, câmpurile microscopice care nu se suprapun (regiunile de interes [ROI]) de 100 µm 2 (30 de câmpuri per pacient) au fost capturate cu un microscop Olympus VANOX AHBT3. Vasele colorate pozitiv, nucleii celulari și macrofagele au fost numărate în aceste ROI, iar dimensiunea secțiunii transversale (denumită diametru) a vaselor a fost măsurată. Numerele medii au fost calculate pe grup de pacienți și analizate statistic după cum se detaliază mai târziu.

Izolarea ex vivo a LEC dermice.

Microprepararea LEC a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (10). Pe scurt, pielea umană a fost dermatomizată și epidermă și dermă dislocate prin incubare în soluție de dispază (Roche nr. 04942086001). Celulele au fost marcate cu anticorpi într-o procedură în trei etape, cu etape intermediare de spălare și sortate (FACStar Plus; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) ca LEC (CD31 + podoplanină pozitivă) și celule endoteliale din sânge (CD31 + podoplanină negativă) cu utilizarea a CD45 ca poartă pentru excluderea leucocitelor.

Izolarea ARN și hibridizarea cipurilor.

Analiza GeneChip a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (10). Pe scurt, ARN-ul total (RNeasy Mini Kit; Qiagen nr. 74104) a fost amplificat (MessageAmp II aRNA Amplification Kit; Ambion nr. AM1751), iar 1 μg de ARN amplificat a fost marcat cu biotină, purificat (MessageAmp II-Biotin Enhanced Kit, Ambion nr. . AM1791) și hibridizate cu Affymetrix GeneChips (GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays), care au fost scanate cu GeneChip Scanner 3000 7G.

Analiza datelor bioinformatice.

Profilurile de expresie genică dLEC și LEC nondiabetice (ndLEC) au fost analizate cu software-ul GeneSpring GX (Ambion). După corectarea fundalului, datele brute au fost normalizate cu metoda robustă multiarray medie, iar valorile P au fost calculate prin testarea t nepereche. Ulterior, 1.828 seturi de sonde cu P ≤ 0.05 au fost folosite pentru gruparea ierarhică bazată pe entități și condiții în conformitate cu regulile de legare metrică distanță și regulile de legătură centroidă euclidiană. Toate datele au fost depuse în Centrul Național pentru Informații despre Biotehnologie (NCBI) Genn Expression Expression Omnibus (GEO) și sunt accesibile prin numărul de acces GEO GSE38396 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc. cgi? acc = GSE38396). O analiză bioinformatică aprofundată suplimentară a fost efectuată prin metoda varianței relative (RVM), care permite analiza statistică a dimensiunilor mici ale eșantionului pe baza unui prag autoadaptativ (11). Cercetările extinse NCBI GEO și PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) au fost modificate pentru a prelua informații despre expresiile genice și relevanța pentru biologia LEC. Ontologia genică (www.affymetrix.com) a fost utilizată pentru a clasifica genele în funcție de funcționalitate. Analiza căilor de ingeniozitate (http://www.ingenuity.com) a fost aplicată pentru a identifica asociații cu funcții particulare, căi canonice și boli.

Reacție în lanț cantitativă de transcriptază inversă - polimerază.

O microgramă de ARN total amplificat a fost transcrisă în ADNc prin transcriptază inversă Superscript II (Invitrogen nr. 18064-014). O listă completă a sondelor este rezumată în Tabelul suplimentar 5.

Cultivarea LEC dermică, stimularea TNF-α și CXCL10 ELISA.

LEC-urile au fost sortate din celule endoteliale microvasculare dermice umane (Promocell nr. C-12260) prin margele magnetice acoperite cu anticorp antipodoplanină. LEC-urile au fost cultivate în mediu bazal endotelial-2 (EBM-2) suplimentat cu 5% FCS și EGM-2-MV SingleQuots (Lonza nr. CC-4147) la 37 ° C și 5% CO2. Pentru stimulările TNF-α, LEC-urile dintre pasajele 5 și 8 crescute până la confluența de 70-80% în plăci cu șase godeuri au fost înfometate peste noapte în EBM-2/0,5% FCS și apoi mediu conținând 10 ng/ml TNF-α (R&D nr. 210-TA-010) timp de 6, 12 și 24 de ore cu sau fără inhibitori de 25 ng/mL ai anticorpului anti-TNF-a. LEC-urile au fost lizate cu tampon RL (Qiagen nr. 79216) și β-mercaptoetanol pentru analiza PCR cantitativă (qPCR) ulterioară. Supernatantele culturii LEC au fost colectate și concentrate de 20 de ori cu unități de filtrare centrifugale (Amicon Ultra-0,5 10K Ultracel R; Millipore nr. UFC501024). Nouăzeci și șase de plăci ELISA au fost acoperite cu supernatante concentrate peste noapte și CXCL10 ELISA a fost efectuat conform protocolului standard (vezi legenda din Fig. 8B Suplimentar). Experimentele au fost efectuate în trei exemplare, iar diferențele statistice între grupuri au fost analizate după cum se detaliază mai târziu.

Motilitatea LEC și testul de dublare a populației.

Pentru analiza migrației, a fost creată o rană de zgârietură în monostratele LEC confluente cultivate în plăci cu 24 de godeuri. Celulele neaderente au fost spălate, s-a adăugat mediu proaspăt cu sau fără TNF-a așa cum s-a descris anterior (n = 3) și închiderea plăgii a fost monitorizată la fiecare oră cu un microscop cu celule vii inversate (Axiovert 200M; Zeiss). Pentru analiza dublării populației, s-au crescut numere LEC identice în șase godeuri cu sau fără adăugare de TNF-α (trei în fiecare grup). După puncte de timp definite, celulele au fost spălate, tripsinizate și numărate într-un hemocitometru. Dublările populației au fost calculate ca ln (concentrația celulelor numărate/concentrația celulelor însămânțate).

Adeziunea macrofagelor și testul de chemotaxie.

analize statistice.

Analizele au fost efectuate cu Microsoft Excel 2007. Diversitatea variației seturilor de date respective a fost determinată de testul F, iar semnificația diferenței a fost evaluată prin testul Student t. P ≤ 0,05 a fost considerat semnificativ.

REZULTATE

Densitate crescută a vaselor limfatice în pielea diabetică de tip 2.

Examenul imunohistologic a relevat colagen îngroșat, laminin și de tip IV care conține membrane bazale ale vaselor de sânge dermice la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 (Fig. 1A și Fig. 1A suplimentar), care este caracteristic microangiopatiei diabetice. Vasele limfatice pozitive pentru podoplanină erau lipsite de laminină, dar acoperite de colagen de tip IV în ambele grupuri (Fig. 1A și Fig. 1A suplimentară), indicând nicio modificare a compoziției membranei bazale. Diametrul mediu al vasului limfatic a fost similar în ambele grupuri (neprezentat), sugerând absența hiperplaziei limfatice microvasculare sau a stării edematoase. Receptorul antigen Duffy pentru chemokine (13,14) a fost stabilit ca un marker distinct pentru petele de vase de sânge ale secțiunilor pielii umane (Fig. 1B suplimentară). Spre deosebire de numărul de vase sanguine nealterate, densitatea vaselor limfatice a fost semnificativ crescută în diabetul de tip 2 (de 1,8 ori, P = 0,035) (Fig. 1B). Mai mult, în timp ce nu s-au găsit nuclee pozitive Ki-67 în probele nondiabetice (Fig. 1C, vârfuri de săgeți), 2% din nuclee (Fig. 1C și Tabelul suplimentar 3) în vasele limfatice pozoplanin-pozitive au exprimat markerul de proliferare Ki-67 în piele diabetică (Fig. 1C, săgeți). Împreună, aceste date sugerează că pielea diabetică prezintă o densitate mai mare a vaselor limfatice, care ar putea fi atribuită creșterii proliferării LEC.

dLEC-urile prezintă un model de expresie genetică separat de ndLEC-uri. Gruparea ierarhică a datelor privind expresia genelor microarray dLEC și ndLEC s-a bazat pe 1.828 seturi de sonde semnificativ dereglate care arată gruparea dLEC și ndLEC în două ramuri separate. Pe axa y, un arbore de entități a fost generat prin gruparea seturilor de probe din cele opt eșantioane de matrice în funcție de similaritatea profilurilor lor de expresie. Pe axa x, a fost generat un arbore de condiții pentru a arăta relația dintre eșantioane. Gama de culori indică diferența de expresie crescută (roșie) și redusă (albastră) a seturilor de sonde între dLEC și ndLEC.

Nivelurile de transcriere a 160 de gene candidate dereglementate funcțional grupate în răspuns inflamator, aderență și migrare LEC, creștere și limfangiogeneză și biochimie cu molecule mici

Niveluri îmbunătățite de TNF-α în pielea diabetică de tip 2 uman ca rezultat al infiltrării macrofagelor. A: Evaluarea imunohistochimică a infiltrării macrofagelor la nivelul pielii la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 versus pacienții normoglicemici. Macrofagele cutanate au fost colorate cu anticorp CD68 anti-uman. Celulele pozitive au fost numărate pe câmp, iar numărul mediu a fost calculat pe grup de pacienți (n = 4 în fiecare grup). Barele de scară = 100 μm. ** celule P +. Barele de scară: = 20 μm. D: Evaluarea cantitativă a macrofagelor CD68 + colocalizând cu TNF-α în nondiabetice vs. pielea diabetică (n = 4 în fiecare grup) a fost efectuată așa cum este descris în A. Scale bare = 100 μm. ** P = 0,002.

TNF-a recapitulează modificările expresiei genei dLEC și duce la o motilitate LEC sporită.

O cascadă de evenimente patogene poate duce la reorganizare vasculară limfatică în pielea diabetică de tip 2. Creșterea încărcării metaboliților și a afluxului de macrofage în timp ar putea duce la modificări moleculare ale LEC dermice. Prin urmare, dLEC-urile relevă un fenotip activat caracterizat prin creșterea statusului inflamator, migrator și limfangiogen și rezistență la apoptoză. Acest fenotip al vasului limfatic poate contribui la inflamația cronică, scăderea apărării împotriva infecțiilor, recrutarea leucocitelor, remodelarea țesuturilor și homeostazia cutanată grav modificată. Mai exact, TNF-α este un mediator cheie al conversației încrucișate între macrofagele proinflamatorii și LEC. Modificările expresiei genei mediate de TNF-α în dLEC pot duce la recrutarea ulterioară a macrofagelor, consolidând expansiunea vaselor limfatice și inflamația cronică. RAGE, un receptor al produsului final de glicație avansată.

DISCUŢIE

În prezent se știe puțin despre patomecanismele manifestărilor cutanate în diabetul de tip 2. Aici ne-am propus să caracterizăm modificările fiziologice ale vaselor limfatice dermice prin utilizarea LEC umane proaspăt izolate. Deși modificările canalului toracic și ale vaselor limfatice musculare au fost descrise la șoarecii diabetici (24,25), fenotipul pielii lor a fost ignorat până acum. Analizele funcționării limfatice dermice, cum ar fi limfangiografia, ar avansa o înțelegere a patogeniei bolii; cu toate acestea, defectele unei singure gene ale acestor șoareci au ridicat îndoieli cu privire la studierea vindecării rănilor diabetice afectate (26). Din câte știm, acest studiu este printre primele (27) care descriu modificările morfologice și moleculare ale vaselor limfatice dermice umane în diabetul de tip 2.

Transcriptomul dLEC nu a arătat nici reglarea descendentă a markerilor cheie de diferențiere limfatică ca în obezitate și inflamație (36,37), nici dereglarea transcrierilor pentru proteinele valvului limfatic, deși integritatea vaselor limfatice perturbate a fost postulată pentru a contribui la obezitate (38). Mai degrabă, suprapunerile semnăturilor de expresie cu LEC sub hipoxie și de la pielea pacienților cu limfedem (39,40) subliniază un rol al acestor gene în disfuncția limfatică patologică. Mai mult, am observat o suprapunere cu transcriptomii complicațiilor diabetului, cum ar fi lizatele de țesut integral din ulcere venoase nevindecătoare (41), inflamația plăgii (42) și microbiomul plății diabetice (43), indicând o semnătură genică comună legată de diabet.

La om, densitatea crescută a vaselor limfatice s-a corelat cu rezultatele pozitive ale bolii (49,50). Cu toate acestea, mai multe rapoarte au indicat faptul că limfangiogeneza determinată de inflamație duce la formarea de vase disfuncționale cu capacitate redusă de drenaj limfatic (9). Recrutarea macrofagelor în dLEC prin chemotaxia CXCL10 ar putea fi indicativă pentru o astfel de eliminare împiedicată, dar ar putea fi, de asemenea, o condiție prealabilă pentru integrarea vaselor limfatice. Într-un model de peritonită condusă de lipopolizaharide, un număr crescut de macrofage au fost strâns atașate de vasele limfatice inflamatorii nou formate, încorporându-se direct în acestea (51). Este tentant să speculăm că macrofagele pielii umane sunt implicate într-un mod analog de expansiune a vaselor limfatice. Vasele limfatice crescute aberant ar putea duce la scăderea lichidului tisular, a lipidelor și a drenajului celulelor imune și, în cele din urmă, a inflamației persistente care împiedică regenerarea pielii. Trebuie explorată întrebarea dacă formarea exagerată a vaselor limfatice este benefică pentru patologia cutanată a diabetului de tip 2.

MULȚUMIRI

M.H. și T.K. au fost finanțate în cadrul programului PhD-CCHD (Comunicare celulară în sănătate și boli) (http://www.meduniwien.ac.at/phd-cchd) sprijinit de Fondul științific austriac (proiectul FWF nr. W1205). GE. a fost susținut de o bursă Elise Richter (FWF V102-B12) și o finanțare internațională pentru reintegrare Marie Curie din FP7 (IRG230984).

Nu au fost raportate potențiale conflicte de interese relevante pentru acest articol.

M.H. a efectuat cercetări, a analizat date și a scris manuscrisul. T.K. a efectuat cercetări și a analizat date. GE. a cercetat datele și a revizuit și editat manuscrisul. H.S., C.W.S. și M.K.B. efectuat cercetări. D.S. date cercetate. C.N. a furnizat materiale de piele umană și date clinice și a contribuit la discuție. D.K. a conceput proiectul și a revizuit și editat manuscrisul. B.H. a proiectat cercetarea, a analizat datele și a scris manuscrisul. B.H. este garantul acestei lucrări și, ca atare, a avut acces deplin la toate datele din studiu și își asumă responsabilitatea pentru integritatea datelor și acuratețea analizei datelor.

Autorii îi mulțumesc Dr. Daniela Haluza, Institutul de Sănătate al Mediului, Universitatea Medicală din Viena (MUW), și Romana Kalt și Ingrid Raab, Institutul Clinic de Patologie, MUW, pentru asistență tehnică excelentă. De asemenea, autorii îi mulțumesc Dr. Martin Bilban, Departamentul de Medicină de Laborator, MUW, pentru ajutor în biostatistică; iar Dr. Maximilian Zeyda, Departamentul de Medicină Internă, MUW și Dr. Andrew Rees și Dr. Georg Krupitza, Institutul Clinic de Patologie, MUW, pentru discuții utile.