Yasuhisa Ano

1 Laboratoare centrale pentru tehnologii cheie, Kirin Company Ltd., 1–13–5 Fukuura Kanazawa-ku, Yokohama-shi, Kanagawa, 236–0004, Japonia,

efectele

Makiko Ozawa

2 Școala Absolventă de Științe Agricole și a Vieții, Universitatea din Tokyo, 1–1–1 Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo, 113–8657, Japonia,

Toshiko Kutsukake

1 Laboratoare centrale pentru tehnologii cheie, Kirin Company Ltd., 1–13–5 Fukuura Kanazawa-ku, Yokohama-shi, Kanagawa, 236–0004, Japonia,

Shinya Sugiyama

3 Koiwai Dairy Products Co., Ltd., 36-1 Maruyachi, Shizukuishi-cho, Iwate, 020-0507, Japonia,

Kazuyuki Uchida

2 Școala Absolventă de Științe Agricole și a Vieții, Universitatea din Tokyo, 1–1–1 Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo, 113–8657, Japonia,

Aruto Yoshida

1 Laboratoare centrale pentru tehnologii cheie, Kirin Company Ltd., 1–13–5 Fukuura Kanazawa-ku, Yokohama-shi, Kanagawa, 236–0004, Japonia,

Hiroyuki Nakayama

2 Școala Absolventă de Științe Agricole și a Vieții, Universitatea din Tokyo, 1–1–1 Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo, 113–8657, Japonia,

Conceput și proiectat experimentele: YA KU AY HN. A efectuat experimentele: YA MO TK. Am analizat datele: YA MO TK. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: SS. Am scris lucrarea: YA HN.

Date asociate

Toate datele relevante se găsesc în lucrare.

Abstract

Introducere

Odată cu creșterea rapidă a populațiilor în vârstă din întreaga lume, declinul cognitiv și demența devin o povară în creștere nu numai pentru pacienți și familiile lor, ci și pentru sistemele naționale de sănătate. Boala Alzheimer este o tulburare cerebrală progresivă ireversibilă, ale cărei simptome includ pierderea memoriei, confuzie, judecată afectată și pierderea abilităților lingvistice, iar numărul persoanelor afectate crește brusc. Deoarece funcția cognitivă scade în conformitate cu o acumulare de amiloid β (Aβ) în creier, depunerea de Aβ este o parte crucială a patologiei [1].

Studii patologice și imunologice recente au arătat că inflamația cronică după depunerea de Aβ în creier este strâns asociată cu patologia bolii Alzheimer [2-4]. Microglia joacă roluri imunologice unice, inclusiv îndepărtarea celulelor și a deșeurilor apoptotice, cum ar fi Aβ prin fagocitoză, precum și apărarea gazdei împotriva infecției cu virusuri în sistemul nervos central [5-6]. Cu toate acestea, în creierul Alzheimer, microglia se infiltrează în regiunea din jurul plăcilor Aβ, se activează excesiv și produce cantități mari de citokine și chemokine inflamatorii, cum ar fi factorul de necroză tumorală-α (TNF-α), proteina inflamatorie a macrofagelor-1α (MIP) -1α), oxigenul reactiv (ROS) și oxidul azotic (NO) [7-9]. Aceste produse, generate cronic de microglie, după depunerea Aβ, sunt toxice pentru neuroni și provoacă moartea celulelor neuronale [7, 10-11].

Numeroase rapoarte sugerează că controlul activităților microgliale este eficient în prevenirea și vindecarea bolii Alzheimer și a declinului cognitiv [12-14]. Studiile epidemiologice sugerează că utilizarea prelungită a antiinflamatoarelor nesteroidiene (AINS), inclusiv medicamentul obișnuit cu ibuprofen, reduce semnificativ riscul bolii Alzheimer [15-16]. În concordanță cu cercetările epidemiologice, sa constatat că tratamentul cronic cu ibuprofen suprimă în mod semnificativ inflamația microglială și dezvoltarea patologiei Aβ la un șoarece model transgenic al bolii Alzheimer [17]. Cu toate acestea, efectele secundare la nivelul tractului gastro-intestinal, ficat și rinichi cauzate de inhibarea ciclooxigenazei I exclud utilizarea pe scară largă a AINS în prevenirea bolii. Prin urmare, tratamentele alternative la boala Alzheimer și la declinul cognitiv trebuie explorate și, ca urmare, abordările preventive bazate pe dietă, exerciții fizice și învățare atrag atenția din ce în ce mai mult.

Mai multe studii epidemiologice recente sugerează că consumul de produse lactate fermentate poate reduce riscul declinului cognitiv la vârstnici și poate preveni demența, inclusiv boala Alzheimer [18-20]. Cu toate acestea, mecanismul de bază și compușii activi rămân a fi elucidați.

În prezentul studiu, efectele preventive ale produselor lactate fermentate au fost evaluate utilizând un model transgenic de șoareci al bolii Alzheimer, cu un accent special pe activitățile microgliale. În plus, după evaluarea animalelor, compușii din produsele lactate au fost selectați pentru a identifica componentele capabile să mărească fagocitoza A beta microgliană și activitatea antiinflamatoare.

Materiale și metode

Animale

Șoarecii gravizi C57BL/6J, șoarecii masculi C57BL/6J de 8 săptămâni și șoarecii masculi CD-1 de 6 săptămâni au fost cumpărați de la Charles River Japonia (Tokyo, Japonia). Șoarecii model de boală Alzheimer, șoarecii B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1 * M146L * L286V, http://jaxmice.jax.org/strain/006554.html, [21]) au fost cumpărați de la Jackson Laboratory (CA, SUA). Șoarecii sub 3 luni au fost hrăniți cu o dietă standard de creștere a rozătoarelor purificată (AIN-93G, drojdie orientală, Tokyo, Japonia), iar cei peste 3 luni cu o dietă de întreținere (AIN-93M, drojdie orientală).

Șoarecii B6SJL-Tg au fost întreținuți în instalația experimentală de la Universitatea din Tokyo, iar experimentele au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Tokyo și efectuate în strictă conformitate cu liniile directoare ale acestora. Șoarecii gravizi C57BL/6J, șoarecii C57BL/6J în vârstă de 8 săptămâni și șoarecii CD-1 în vârstă de 6 săptămâni au fost menținuți în Kirin Company Ltd, iar experimentele au fost aprobate de Comitetul de Experimentare Animală al Kirin Company Ltd și efectuate respectarea strictă a orientărilor lor. S-au făcut toate eforturile pentru a minimiza suferința.

Pregătirea probei de produs lactat fermentat cu Penicillium candidum

Produsele lactate fermentate cu peniciliu (P.) (brânză camembert) au fost preparate conform unei proceduri generale de fabricație. Pe scurt, laptele sterilizat a fost fermentat cu Lactococcus lactis pentru a reduce pH-ul și tratat cu cheag de vițel. Cașul agregat a fost fermentat de P. candidum. Produsele fermentate au fost apoi liofilizate și delipidate cu n-hexan (Wako, Tokyo, Japonia) pentru a îndepărta trigliceridele. Compoziția nutritivă a probelor extrase a fost calculată de Laboratoarele Japoneze de Cercetare Alimentară (Tokyo, Japonia).

Dietele AIN-93G și AIN-93M (drojdie orientală) conținând probă fermentată 2% (greutate/greutate) au fost preparate printr-o procedură convențională și fiecare dietă cu sau fără probă a fost ajustată pentru a conține aceleași calorii în funcție de compoziția nutritivă a proba extrasă.

Analiza depunerii Aβ1-42 și a inflamației cronice în creierul transgenic murin

Pentru a evalua efectele produselor lactate fermentate asupra bolii Alzheimer, șoarecii transgenici și de tip sălbatic de 3 luni au fost hrăniți cu o dietă cu sau fără probă fermentată (2% g/g) timp de trei luni (n = 11 șoareci în fiecare grup). La vârsta de 6 luni, șoarecii au fost eutanasiați și creierul a fost îndepărtat. Emisfera stângă a creierului a fost omogenizată în tampon RIPA (Wako) cu un șoc multi-margele (Yasui Kikai, Osaka, Japonia). După centrifugare la 500.000 × g timp de 20 de minute, concentrația totală de proteine ​​a supernatantului a fost măsurată cu un kit de testare a proteinei BCA (ThermoScientific, Yokohama, Japonia). Pentru a cuantifica Aβ1-42 (Wako), MIP-1α (sisteme de cercetare și dezvoltare, MN, SUA), TNF-α (eBiosciences, CA, SUA), IL-1β (eBiosciences), sinaptofizină (Life Science Inc., FL, SUA), BDNF (Promega, WI, SUA), GDNF (Promega) și NGF (Promega) în hipocampus, a fost utilizat un kit ELISA adecvat. Emisferele drepte au fost fixate în 10% formalină (Wako) și analizate imunohistochimic folosind următorii anticorpi specifici: anti-Aβ1-42 (policlonal, Invitrogen, CA, SUA), anti-Iba-1 (policlonal, Wako) și anti- MIP-α (policlonale, sisteme de cercetare și dezvoltare).

Prepararea extractului lipidic

Suprafața și interiorul produsului lactat fermentat cu sau fără P. candidum au fost zdrobite într-un mortar după liofilizare și extrase cu n-hexan, cloroform și apoi cu metanol. Pentru analiza spectrometrului de masă prin cromatografie cu gaze (GC/MS), probele liofilizate au fost suspendate în metanol conținând KOH 1N și saponificate la 80 ° C timp de 2 ore. Fracția lipidică a fost obținută așa cum s-a descris anterior [22] cu unele modificări. Vehiculul (cloroform: apă = 10: 9) a fost adăugat la fracție (raport final: aproximativ 1: 1: 0,9, v/v/v; cloroform: metanol: apă), care a fost apoi vortexat timp de 20 de minute și centrifugat la 3000 rpm timp de 10 min. Faza inferioară a fost uscată sub un curent de N2 la 40 ° C, dizolvată în acetonă și filtrată printr-un disc cu membrană din politetrafluoretilenă (Millipore, MA, SUA).

Condiții GC/MS

Analiza pentru amidele acizilor grași primari utilizând GC/MS a fost descrisă anterior [23]. Pentru analiza a fost utilizat un sistem Agilent Technologies Network GC/MS (7890 GC cu detector de masă 5975) cu o coloană capilară HP-5MS (diametru intern de 0,25 mm, grosime a filmului de 0,25 μm, lungime de 30 m, Agilent Technologies). Temperatura a fost inițial menținută la 80 ° C timp de 1 min, ridicată până la 280 ° C la o rată de 30 ° C pe min, și apoi menținută la 280 ° C timp de 23 min. Durata totală de rulare a fost de 30,7 min. Heliul a fost utilizat ca gaz purtător cu un debit de 1,2 ml/min. Ionizarea a fost obținută prin impactul electronilor (energie electronică, 70 eV). Temperatura orificiului de injecție și a liniei de transfer a fost de 250 ° C. S-a utilizat injecția fără despărțire cu un volum de 1 μl.

Cultură celulară microglia primară

Celulele creierului au fost obținute de la șoareci nou-născuți C57BL/6J sau șoareci de 6 luni B6SJL-Tg prin tratament cu papaină utilizând un kit de disociere a țesutului neuronal (P) (Miltenyi Biotec, MA, SUA). Celulele au fost tratate cu 2 μg/ml de anticorp anti-CD11b conjugat cu microbere (Miltenyi Biotec), iar celulele CD11b pozitive au fost izolate prin sortare de celule magnetice (MACS). Celulele izolate cu mai mult de 90% puritate au fost placate într-o placă cu 96 de godeuri acoperite cu poli-D-lizină (PDL) (BD Biosciences, MA, SUA) și cultivate în mediu DMEM/F-12 (Gibco, CA, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal de vițel (Gibco) și 100 U/ml de peniciliu/streptomicină (Sigma-Aldrich, MO, SUA).

Test de producere a citokinelor in vitro

Microglia izolată de la șoareci nou-născuți C57BL/6J și șoareci B6SJL-Tg de 6 luni au fost acoperiți cu o densitate de 30.000 pe godeu într-o placă acoperită cu PDL, tratați cu fiecare probă extrasă și cu acizi grași conținuți în principal în lapte (acid linoleic, acid linolenic, acid oleic, acid stearic, acid linoleic conjugat, Sigma-Aldrich) și oleamidă (Sigma-Aldrich) timp de 12 ore, și apoi tratat cu lipopolizaharidă (LPS, 5 ng/ml, Sigma-Aldrich) și interferon- γ (IFN-γ, 0,5 ng/ml, sisteme R&D) timp de 12 ore. După stimularea LPS, supernatanții au fost aplicați la un test de producție TNF-α și celulele au fost evaluate pentru exprimarea markerilor celulari folosind un citometru de flux FACS Canto II (BD Bioscience) după colorare cu următorii anticorpi: 2 μg/ml de anti-CD11b -APC-Cy7 (BD Pharmingen), 1 μg/ml de anti-CD206-PerCP-Cy5.5 (BioLegend, CA, SUA), 1 μg/ml de anti-CD68-APC (BioLegend) și 2 μg/ml de anti-CD80-PE (eBiosciences).

Pentru a măsura producția de citokine intracelulare, celulele microgliale au fost tratate cu un cocktail de activare a leucocitelor folosind BD GolgiPlug (BD Biosciences) timp de 12 ore și cu un kit BD Cytofix/Fixare citopermă/Permeabilizare (BD Biosciences) și apoi colorate cu următorii anticorpi: anti - MIP-1α-PE, 2 μg/ml (eBiosciences); anti-TNF-α-FITC, 1 μg/ml (eBiosciences); anti-interleukin-1β (IL-1β) -FITC, 2 μg/ml (eBiosciences); anti-IL-12p40/p70-APC, 2 μg/ml (BD Pharmingen); anti-CD11b-APC-Cy7, 2 μg/ml; și anti-CD206-PerCP-Cy5.5, 1 μg/ml. Celulele au fost analizate prin citometrie în flux.

Test antiinflamator in vivo

Fagocitoza Aβ1-42 marcată cu 6-carboxifluoresceină prin microglia

Fagocitoza microglială a Aβ1-42 marcată cu 6-carboxifluoresceină (Aβ-FAM, AnaSpec, CA, SUA) a fost evaluată printr-un test pe plăci. Celulele microgiale izolate de la șoareci nou-născuți au fost placate la o densitate de 50.000 celule pe godeu într-o placă cu 96 de godeuri acoperite cu PDL și incubate cu Aβ-FAM 500 nM timp de 24 de ore după fie acid oleic (Sigma-Aldrich), fie oleamidă (Sigma- Aldrich) pretratament timp de 12 ore. După îndepărtarea mediului, Aβ-FAM extracelular a fost stins cu 0,2% albastru tripan, pH 4,4. Fluorescența celulară a fost măsurată la excitație de 485 nm/emisie de 535 nm utilizând un cititor de plăci (Molecular Device, CA, SUA).

Test de fagocitoză in vivo

Șoarecilor masculi C57BL/6J de opt săptămâni li s-au administrat oral 0, 10 sau 50 mg/kg de oleamidă dizolvată în vehicul, inclusiv 5% etanol (Wako), 5% cremofor (Sigma-Aldrich) și 90% soluție salină (Otsuka) o dată pe zi timp de 3 zile (n = 5 șoareci din fiecare grup). La trei ore după ultima administrare, microglia din creier a fost izolată de MACS, iar activitatea fagocitotică a microgliei a fost măsurată folosind Aβ-FAM așa cum s-a descris mai sus. Populațiile de celule CD206 și CD11b pozitive și expresia markerilor celulari au fost analizate folosind un citometru de flux după colorare cu 2 μg/ml de anticorp anti-CD36-APC (BioLegend) și 2 μg/ml de anti-CD11b-APC -Anticorp Cy7 (BD Pharmingen).

analize statistice

Toate valorile au fost exprimate ca medie ± SEM. Datele din testele de producție pentru citokine, chemokine, factori neurotrofici și sinaptofizină și din testele antagoniste in vitro au fost analizate prin ANOVA bidirecțională, urmată de testul Tukey-Kramer. Datele din testele in vitro au fost analizate prin ANOVA unidirecțională, urmată de testul Dunnett sau testul t Student. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind programul software Ekuseru-Toukei 2012 (Social Survey Research Information, Tokyo, Japonia).

Rezultate

Aportul produsului lactat fermentat reduce substanțial sarcina și inflamația Aβ

Cantitatea de Aβ1-42 solubil în creier la șoareci transgenici 5xFAD a fost semnificativ redusă cu 17% în grupul hrănit cu proba de lapte (Fig. 1A). Aβ1-42 insolubil în cortexul cerebral a detectat imunohistochimia a scăzut cu 21% în grupul de probă, dar reducerea nu a fost semnificativă (Fig. 1B, C, D). Examinarea patologică a colorării prin imunohistochimie a relevat că sarcina Aβ1-42 a fost redusă cu 21% în cortexul cerebral, dar cu 12,5% în hipocamp. Micoglia Iba-1-pozitivă s-a infiltrat masiv și a înghițit Aβ1-42 (Fig. 1E) și a produs MIP-1α (Fig. 1F). Producția sporită de MIP-1α la șoarecii transgenici a fost suprimată semnificativ prin administrarea produsului lactat (Fig. 1H).