Amani A. Harb

1 Departamentul de Științe Biologice, Facultatea de Științe, Universitatea din Iordania, Amman 11942, Iordania

Yasser K. Bustanji

2 Facultatea de Farmacie, Universitatea din Iordania, Amman 11942, Iordania

Shtaywy S. Abdalla

1 Departamentul de Științe Biologice, Facultatea de Științe, Universitatea din Iordania, Amman 11942, Iordania

Abstract

Introducere

Hiperlipidemia, în special hipercolesterolemia, este cunoscută ca fiind un factor major în dezvoltarea bolilor cardiovasculare, a ficatului gras și a carcinogenezei, ducând la probleme de sănătate și la moarte în întreaga lume. (1) Sa constatat că o dietă care conține o cantitate mare de grăsimi este asociată cu un risc crescut de obezitate și hiperlipidemie la om și la rozătoare, deoarece crește nivelul colesterolului și al trigliceridelor (TG) în plasmă și țesuturi. (2)

În prezent, sunt disponibile medicamente farmacologice pentru tratarea eficientă a hiperlipidemiei, dar acestea au o multitudine de efecte adverse, o chestiune care i-a motivat pe cercetători să caute alternative naturale. (3) De exemplu, compușii antioxidanți naturali s-au dovedit a fi utili în atenuarea gradului de hipercolesterolemie deoarece corectează dezechilibrul dintre radicalii liberi (pro-oxidanți) rezultat din creșterea nivelului de colesterol și anti-radicalii liberi (antioxidanți). (4,5)

Sesquiterpene dietetic β-cariofilena (BCP) este un compus volatil găsit ca o componentă majoră a uleiurilor esențiale ale multor plante alimentare și condimente, inclusiv piper negru (Piper nigrum), (6) oregano (Oreganum vulgare), (7) scorțișoară (Cinnamon spp.), (8) cuișoare (Eugenia caryophyllata), (9) cimbru (Salvia spp.), (10) rozmarin (Rosmarinus officinalis), (11) și hamei (Humulus lupulus) și probabil multe alte specii. (12) De exemplu, s-a constatat că BCP formează până la 35% din uleiul esențial al plantei de cânepă Cannabis sativa. (13) În plus față de utilizările sale ca aditivi alimentari și produse cosmetice, BCP are activități anti-oxidante și antiinflamatorii apreciabile și a fost utilizat în boli asociate cu inflamația și stresul oxidativ. (14) Gertsch și colab. (15) au arătat că BCP se leagă selectiv de situsul de legare a tetrahidrocanabinolului (situsul de legare CP55940) al receptorului canabinoid-2 (CB2), ducând la activarea celulară și efecte antiinflamatorii. Receptorii CB2 mediază multe efecte fiziologice și patologice, inclusiv inflamația, formarea edemelor, efectele analgezice, leziunea reperfuziei ischemice, ateroscleroza și osteoporoza. (15)

BCP a fost aprobat de mai multe agenții de reglementare a alimentelor și aromelor pentru a fi utilizat ca aditiv alimentar și a fost clasificat ca un compus „în general considerat sigur”. (11) Acest compus a creat un interes pentru mulți cercetători ca un lider pentru dezvoltarea medicamentelor, (21) prin urmare, această lucrare a fost întreprinsă pentru a testa ipoteza că BCP are efecte hipolipidemice la șobolanii Wistar hrăniți cu o dietă bogată în colesterol și grăsimi.

Materiale și metode

Produse chimice

Colesterolul (puritate 94%, Sigma-Aldrich, Japonia), acidul colic (puritate> 98%, Sigma-Aldrich, Noua Zeelandă) și BCP (puritate> 98,5%, Sigma-Aldrich, România) au fost achiziționate din sursele indicate. Atorvastatin calciu a fost furnizat cu amabilitate de SANA Pharmaceuticals, Amman, Iordania. Kituri enzimatice pentru analiza cantitativă a colesterolului total (TC), TG, HDL, aspartat aminotransferazei (AST), alanine aminotransferazei (ALT), fosfatazei alcaline (ALP) și lactatului dehidrogenazei (LDH) au fost achiziționate de la Biosystem, Barcelona, ​​Spania . Kituri de testare comerciale utilizate pentru determinarea activității enzimei catalazei (CAT) (Cayman's Catalase Assay Kit, Item No. 707002) și a enzimei superoxid dismutazei (SOD) (Cayman's Superoxide Dismutase Assay Kit, Item No. 706002) au fost achiziționate de la Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI).

Pregătirea unei diete bogate în colesterol și grăsimi (HCFD)

HCFD este un chow de șobolan standard suplimentat cu 1% acid colic, 2% pulbere de colesterol pur, 20% grăsime (sursă animală) și 2% ulei de porumb. Componentele au fost adăugate treptat la dieta normală a solului, complet amestecate până la omogenizare, formate într-un aluat cu adăugare de apă distilată (1.000 ml), înfășurate folosind instrumente simple, tăiate în pelete mici și lăsate să se usuce la temperatura camerei timp de 2 -3 zile. Dieta a fost pregătită săptămânal și a fost păstrată la 4 ° C până la utilizare pentru a reduce oxidarea. HCFD a fost compus din: carbohidrați 43,57%, proteine ​​brute 12,38%, fibre brute 4,73%, grăsimi brute 3,17%, colesterol 2%, acid colic 1%, grăsimi animale 20%, ulei de porumb 2%, cenușă totală 4,3% și umiditate 6,85%, în timp ce dieta normală conținea 58,1% carbohidrați, 16,51% proteine ​​brute, 0% grăsimi animale, ulei de porumb, colesterol și acid colic, cu celelalte componente nu sunt modificate semnificativ. Ambele tipuri de dietă au fost analizate în Analiza Laboratorului Furajelor, Departamentul de Producție Animală, Facultatea de Agricultură, Universitatea din Iordania, Amman.

Animale și design experimental

Animalele au fost adăpostite, hrănite și tratate în conformitate cu liniile directoare etice ale Universității din Iordania pentru protecția animalelor și aprobarea experimentală. Șobolani Wistar masculi adulți (n = 48), cu o greutate de 150-180 g, au fost ținuți timp de o săptămână în mediul de laborator pentru aclimatizare, apoi împărțiți aleatoriu în șase grupuri (câte 8 animale), după cum urmează:

Grupul 1 (control normal), șobolanii au fost hrăniți cu o dietă normală timp de 6 săptămâni. În ultimele 4 săptămâni de studiu, vehiculul (ulei de porumb) a fost dat. În celelalte 5 grupuri, hipercolesterolemia a fost indusă prin hrănirea șobolanilor cu HCFD timp de 2 săptămâni. Șobolanii care aveau niveluri totale de colesterol peste 200 mg/dl au fost considerați hipercolesterolemici și au fost împărțiți în mod aleatoriu în 5 grupuri (grupele 2-6): (29)

Grupa 2 (control negativ), tratată cu vehiculul (ulei de porumb).

Grupa 3 (control pozitiv), tratată cu medicamentul de referință hipocolesterolemiant atorvastatină, în doză de 20 mg/kg b.w.

Grupa 4, tratată cu BCP în doză de 30 mg/kg în greutate corporală. (BCP 30).

Grupa 5, tratată cu BCP în doză de 100 mg/kg în greutate corporală. (BCP 100).

Grupa 6, tratată cu BCP în doză de 300 mg/kg în greutate corporală. (BCP 300).

Toate tratamentele au fost administrate o dată pe zi într-un volum de 0,5 ml/animal prin gavaj oral conform protocolului prezentat în Fig. 1. Dozele de BCP au fost selectate pe baza LD50 și a studiilor publicate anterior care indicau LD50 oral de BCP pentru șobolani să fie> 5.000 mg/kg. (30-32)

efectul

Proiectarea studiului: cu excepția grupului 1, toate grupurile au fost supuse unei diete ridicate de colesterol și grăsimi (HCFD) pe o perioadă de 6 săptămâni.

Prelevarea de sânge

Sângele a fost colectat din plexul retrorbital al ochiului la 0, 2, 3, 4, 5 și 6 săptămâni. Animalele au fost postite peste noapte și ușor anesteziate cu dietil eter. S-au extras doi ml de sânge, s-au transferat cu vacutainere sterile cu gel, s-a lăsat să se coaguleze la temperatura camerei timp de 1 oră, centrifugate timp de 10 minute la 3.000 rpm. Serul a fost separat și depozitat în tuburi Eppendorf la -20 ° C pentru analize biochimice. La sfârșitul experimentului, șobolanii au fost postiti peste noapte, cântăriti și sacrificați printr-o supradoză de dietil eter. S-a colectat mai mult sânge (4 ml) prin ambii ochi și serul a fost obținut și depozitat așa cum s-a menționat mai sus. Ficatul a fost îndepărtat, cântărit și o mică parte a lobului drept a fost excizată, fixată în soluție salină de formol 10% pentru examen histologic.

Măsurarea profilului lipidic în probele de ser

Nivelurile TC, TG și HDL au fost măsurate enzimatic folosind kituri de testare comerciale conform instrucțiunilor producătorului. LDL a fost calculat utilizând ecuațiile LDL = TC - [(HDL + foarte LDL (VLDL)] și VLDL = TG/5. Indicele aterogen (AI) și raportul HDL/TC (HTR) au fost calculate pentru ultima săptămână a experimentează după cum urmează:

Activitatea enzimelor marker hepatice din probele de ser

Activitățile AST, ALT, ALP și LDH au fost măsurate enzimatic în proba de ser pentru ultima săptămână a experimentului folosind kituri de testare comerciale conform instrucțiunilor producătorului.

Activitatea enzimelor antioxidante din probele de ser

Superoxid dismutază (SOD)

Activitatea SOD serică a fost măsurată pe cititorul de plăci ELISA la o lungime de undă de 450 nm folosind un kit de testare colorimetrică conform instrucțiunilor producătorului.

Catalază (CAT)

Activitatea serică CAT a fost măsurată pe cititorul de plăci ELISA la o lungime de undă de 540 nm folosind un kit de testare colorimetrică conform instrucțiunilor producătorului.

Măsurarea activității HMG-CoA reductază (raportul HMG-CoA/mevalonat) în omogenizarea ficatului

Activitatea HMG-CoA reductazei a fost măsurată în omogenizarea ficatului folosind procedura lui Rao și Ramakrishnan. (33) Raportul dintre HMG-CoA și mevalonat a fost luat ca un indice de activitate enzimatică care catalizează conversia HMG-CoA în mevalonat. Raporturile mai mici indică o activitate enzimatică mai mare și invers.

Examen histologic al ficatului

Ficatele au fost îndepărtate de la șobolani, fixate în soluție salină de formol 10%, prelucrate pentru încorporarea parafinei, tăiate în secțiuni cu grosimea de 5 µm folosind microtom rotativ, montate pe lamele și colorate cu hematoxilină - eozină. Zece câmpuri microscopice de lumină din fiecare secțiune au fost examinate și punctate pentru gradul de steatoză sub un microscop compus de lumină la 200X. Steatoza hepatică a fost evaluată cantitativ ca procent de hepatocite care conțin grăsime macrovesiculară utilizând sistemul de notare și notare al lui Kawasaki și colab. (34) Grăsimea macrovesiculară se referă la picăturile de grăsime similare sau mai mari decât dimensiunea nucleului, deplasând adesea nucleul. (35)

analize statistice

Indicele aterogen și raportul HDL/TC au fost calculate pentru șobolani până la sfârșitul ultimei săptămâni a experimentului. Grupa 1, normal + ulei de porumb (vehicul) (n = 7); grupa 2, HCFD + ulei de porumb (n = 8); grupul 3, HCFD + 20 mg/kg de atorvastatină (n = 7); grupa 4, HCFD + 30 mg/kg BCP (n = 7); grupul 5, HCFD + 100 mg/kg de BCP (n = 6); grupul 6, HCFD + 300 mg/kg de BCP (n = 6). Datele sunt exprimate ca medii ± SEM și sunt analizate folosind ANOVA unidirecțional, urmată de testul diferenței cel mai puțin semnificativ al lui Fisher. Diferite litere din același rând indică diferențe semnificative la p 0,05) între grupul 3 și grupul 4 în raportul HMG-CoA/mevalonat (Fig. 3). Acest efect asupra HMG-CoA reductazei a fost observat numai cu 30 mg/kg BCP, dar nu și cu doze mai mari (100 și 300 mg/kg).

Efectul BCP asupra stării antioxidante

Activitatea SOD serică a fost suprimată (p 5 A). Nu s-a observat nicio diferență semnificativă în activitatea acestei enzime între grupul 1 și grupul 4. În grupurile 5 și 6, activitatea CAT, dar nu a celor din SOD, a crescut semnificativ (p 5 B). Activitatea SOD a scăzut destul de semnificativ în grupurile 5 și 6 în comparație cu grupa 4.

În lucrarea de față, administrarea zilnică de 30 mg/kg de BCP la șobolani hipercolesterolemici timp de patru săptămâni succesive a cauzat o scădere evidentă a TC serice, precum și a LDL (31,6% și respectiv 39,1%), deși această scădere a TC și LDL a fost mai mică decât cea indusă de medicamentul de referință hipocolesterolemiant atorvastatină (56,6%, respectiv 66,8%). În plus, această doză de BCP a crescut nivelul HDL cu 43,4%, efect comparabil cu cel indus de atorvastatină (47,1%). Cu toate acestea, această doză de BCP nu a avut niciun efect detectabil la nivelul TG, probabil din cauza porțiunii scăzute de carbohidrați din dietă, așa cum sa discutat mai sus. Aceste observații sunt în parte în concordanță cu rezultatele unui studiu recent care utilizează hiperlipidemia indusă de Triton WR-1339 la șobolani. (38) Acest studiu a constatat că BCP a redus colesterolul total, trigliceridele și colesterolul LDL, nu a crescut colesterolul HDL, a inhibat activitatea HMG-CoA reductază și a ameliorat sistemul antioxidant.

AI și HTR% au fost considerați ca indicatori pentru aterogeneză. (39) În prezentele experimente, 30 mg/kg de BCP au suprimat nivelul ridicat de AI într-un grad comparabil cu cel indus de atorvastatină și a ridicat nivelul scăzut de HTR% la șobolanii hipercolesterolemici.

Interesant, BCP părea să fi inhibat HMG-CoA reductaza, enzima care limitează rata în calea biosintetică a colesterolului, iar această inhibiție a fost comparabilă cu cea indusă de atorvastatină. Această observație indică faptul că efectul hipocolesterolemiant al 30 mg/kg de BCP se datorează inhibării sintezei endogene de colesterol.

Ficatul este considerat, în general, ca principalul organ responsabil de menținerea homeostaziei colesterolului. În studiul actual, șobolanii hipercolesterolemici au prezentat ficat mărit, cu culoare palidă și textură fragilă, comparativ cu șobolanii normali. Hepatomegalia poate fi atribuită conținutului ridicat de grăsimi. (40) Se crede că un nivel ridicat al colesterolului seric dăunează hepatocitelor, ducând la funcționarea defectuoasă a ficatului, prin steatoză macro și microvesiculară. (41) Examenul histologic al ficatului hipercolesterolemic de șobolan, a demonstrat acumularea de lipide (macrosteatoză moderată), pierderea integrității hepatocitelor, mărirea hepatocitelor și deplasarea nucleului.

Pe de altă parte, șobolanii hrăniți cu HCFD tratați cu 30 mg/kg de BCP au prezentat o creștere a ficatului mai mică, sugerând o mai mică depunere de lipide în hepatocite. Examenul histologic a arătat că acumularea de lipide în celulele hepatice de la animalele tratate cu 30 mg/kg de BCP a scăzut, indicând faptul că administrarea orală de 30 mg/kg de BCP ar putea ameliora stresul hepatic cauzat de hipercolesterolemie și poate atenua severitatea ficatului gras. Într-adevăr, procentul de steatoză hepatică a susținut aceste observații, deoarece steatoza a fost semnificativ redusă prin tratamentul cu 30 mg/kg de BCP. În sprijinul acestui fapt, Calleja și colab. (16) au raportat că BCP a redus gradul de steatoză și gradul de fibroză hepatică indusă de tetraclorură de carbon (CCl4) la șobolani. Recent, Kamikubo și colegii săi au demonstrat, de asemenea, rolul BCP în inhibarea acumulării de lipide în hepatocite la nivel molecular. (24) Au arătat că BCP stimulează activarea AMPK prin fosforilare, efect mediat de calea de semnalizare Ca2+ dependentă de receptorul CB2. Calea de semnalizare AMPK activată îmbunătățește oxidarea acizilor grași și atenuează lipogeneza.

În lucrarea de față, 30 mg/kg de BCP au redus efectiv ALT și AST serice, care sunt cunoscute ca fiind enzime markere pentru leziunile hepatice, o observație care indică faptul că BCP protejează împotriva leziunilor hepatice induse de HCFD și îmbunătățește funcțiile hepatice. Observații similare au fost raportate de Calleja și colab. (16) unde BCP a suprimat activitățile crescute ale ALT, AST, ALP și LDH la șobolanii tratați cu CCl4. Într-un alt studiu, Shyamala și colegii săi au descoperit că cuișoarele ar putea scădea ALT și AST serice la șobolanii hiperlipidemici, efect care se poate datora, parțial, BCP ca una dintre principalele sale componente bioactive. (42)

S-a demonstrat că hipercolesterolemia minimizează eficiența sistemului de apărare antioxidant prin reducerea activității CAT și SOD la șobolani. (5) Datele noastre susțin această observație și au arătat, de asemenea, că 30 mg de BCP au inversat acest efect ridicând activitatea enzimei antioxidante a SOD seric (și CAT, deși nu a atins o semnificație statistică) la un nivel apropiat de cel observat în mod normal șobolani, sugerând că BCP a stimulat sistemele antioxidante. Această observație este în concordanță cu un studiu recent care a arătat că administrarea orală de BCP la șobolanii diabetici a îmbunătățit activitățile SOD și CAT. (31) În mod similar, Calleja și colab. (16) au raportat că BCP a fost un inhibitor eficient al peroxidării lipidelor, probabil datorită activității sale de eliminare a radicalilor liberi împotriva radicalilor hidroxilici, a anionilor superoxizi și a peroxizilor lipidici. Mai mult, s-a constatat că cuișorul, o plantă bogată în BCP, ar putea crește activitatea SOD și CAT la șobolanii hiperlipidemici. (42) Capacitatea antioxidantă a BCP poate fi legată de structura sa chimică, cum ar fi prezența unui sistem biciclic cu inele duble. (17)

În concluzie, BCP joacă un rol eficient în scăderea nivelului de TC și LDL, crește nivelul HDL și reduce acumularea de lipide hepatice la șobolanii hipercolesterolemici atunci când este utilizată în doză de 30 mg/kg. Mecanismul de bază al acțiunii de scădere a colesterolului va fi probabil prin eliminarea ROS, ducând la dezactivarea HMG-CoA reductazei și inhibarea sintezei endogene de colesterol. Aceste observații indică faptul că BCP poate fi examinat în continuare ca un medicament terapeutic util în tratarea hipercolesterolemiei și a bolilor hepatice grase.