Jianmin Liu

1 Colegiul de acupunctură-moxibustie și ortopedie, Universitatea Hubei de Medicină Chineză, Wuhan, China

guanyuan

2 Hubei Provincial Collaborative Innovation Centre of Preventive Treatment by Acupuncture & Moxibustion, Wuhan, China

Jing Liu

1 Colegiul de acupunctură-moxibustie și ortopedie, Universitatea Hubei de Medicină Chineză, Wuhan, China

2 Hubei Provincial Collaborative Innovation Centre of Preventive Treatment by Acupuncture & Moxibustion, Wuhan, China

Guang’an Wang

3 Al Treilea Colegiu de Medicină Clinică, Universitatea Henan de Medicină Chineză, Zhengzhou, China

Guangya Liu

1 Colegiul de acupunctură-moxibustie și ortopedie, Universitatea Hubei de Medicină Chineză, Wuhan, China

2 Hubei Provincial Collaborative Innovation Centre of Preventive Treatment by Acupuncture & Moxibustion, Wuhan, China

Huanjiao Zhou

1 Colegiul de acupunctură-moxibustie și ortopedie, Universitatea Hubei de Medicină Chineză, Wuhan, China

Yun Fan

1 Colegiul de acupunctură-moxibustie și ortopedie, Universitatea Hubei de Medicină Chineză, Wuhan, China

Fengxia Liang

1 Colegiul de acupunctură-moxibustie și ortopedie, Universitatea Hubei de Medicină Chineză, Wuhan, China

2 Hubei Provincial Collaborative Innovation Centre of Preventive Treatment by Acupuncture & Moxibustion, Wuhan, China

Hua Wang

1 Colegiul de acupunctură-moxibustie și ortopedie, Universitatea Hubei de Medicină Chineză, Wuhan, China

2 Hubei Provincial Collaborative Innovation Centre of Preventive Treatment by Acupuncture & Moxibustion, Wuhan, China

Date asociate

Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Abstract

Introducere

Materiale și metode

Tratamentul animalelor

Treizeci de șobolani masculi SD în vârstă de 3 luni au fost obținuți de la Centrul Experimental pentru Animale din Universitatea de Medicină Hebei, China [Număr licență experimentală de producție animală: SCXK (Hebei) 2008-1-003]. Toți șobolanii au fost crescuți în cuști ventilate individual cu temperatura cuprinsă între 20 ° C și 25 ° C. Umiditatea a fost între 45% și 55%. Lumina a fost furnizată de la 8 am la 8 pm pentru a simula ritmurile circadiene în timp ce mâncarea și apa erau oferite suficient. Toate tratamentele la animale au fost aprobate de Comitetul de etică animală al Universității Hubei de Medicină Chineză, nr. [2016] IEC (010).

După o săptămână de adaptare, șobolanii au fost împărțiți în mod aleatoriu în trei grupuri, după cum urmează: grupul de control (C), grupul de model de îmbătrânire subacută (M) și grupul de electroacupunctură (M + EA), 10 șobolani pentru fiecare grup . Șobolanii din grupa C au fost crescuți în mod normal, fără niciun tratament. În timp ce șobolanii model de îmbătrânire subacută au fost obținuți prin D-galactoză s.c. injectare continuă timp de 40 de zile de la a doua săptămână. Concentrația de D-galactoză s.c. a fost de 350 mg.kg-1.d-1, o dată pentru fiecare zi [29]. Șobolanii din grupa M au fost crescuți fără tratament după modelare. În timp ce grupul Rats of M + EA a început tratamentul EA la Guanyuan (CV 4), Zusanli (ST 36) și Baihui (DU 20) o dată pe zi după modelare timp de 27 de zile (procedurile sunt prezentate după cum urmează). Procesul experimentului a fost prezentat în figurile S1. Temperatura corpului, temperatura limbii și greutatea șobolanilor din diferite grupuri au fost măsurate la fiecare trei zile în timpul modelării și procedurilor de electroacupuntură pentru a se asigura că indicatorii fiziologici ai șobolanilor sunt normali. S-au făcut toate eforturile pentru a minimiza suferința.

Tratamentul cu electroacupunctură (EA)

Ace sterile de acupunctură (dimensiune: φ0.30 * 25 mm (diametru: 0.30 milimetri, lungime: 25 milimetri); realizat de Suzhou Acupuncture & Moxibustion Appliance Co., Lid, Suzhou, P.R. China] și generatorul de impulsuri (6805-II, Shanghai Taicheng development development co., LTD) au fost utilizate în timpul tratamentului EA. Ace au fost inserate perpendicular în stratul muscular la Guanyuan (CV 4), Zusanli (ST 36) și introduse orizontal în țesutul subgaleal în punctul Baihui (DU 20) la o adâncime de 2 mm. Acupunctul Guanyuan (CV 4) a fost conectat la sarcina negativă a generatorului de impulsuri și Zusanli (Zusanli bilaterali au fost folosiți alternativ în tratamentul EA) a fost conectat la sarcina pozitivă (2 Hz, 1 mA, a durat 15 minute). Baihui (DU 20) a fost stimulat cu ace în același timp: după ce acul a atins locația dorită, să se răsucească și să rotească acul înapoi și înainte continuu cu frecvența de 2-3 ori pe secundă timp de 30 de secunde. Aceeași manipulare s-a făcut după fiecare 5 minute de trei ori până la retragerea acului. Tratamentul EA a fost efectuat în fiecare zi, cu excepția duminicii și a durat 27 de zile. Acest protocol de tratament cu electroacupunctură (EA) a fost depus în protocols.io. Link-ul identificatorului digital de obiect (DOI) este: http://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.ky8cxzw.

Prelevarea de țesuturi

La sfârșitul tratamentului EA, șobolanii din trei grupuri au fost postiti peste noapte. Apoi, toți șobolanii au fost uciși prin dislocarea vertebrei cervicale și creierele au fost excizate rapid după anestezie intraperitoneală folosind sodiu pentobarbital. Probele colectate au fost spălate cu ser fiziologic normal. Ulterior, zona hipocampului a fost împărțită, înghețată în azot lichid și apoi menținută sub -80 ° C pentru extracția ARN-ului. Suprafața hipocampului de zece șobolani din fiecare grup alcătuiește un eșantion și apoi cele trei probe din grupul C, grupul M și grupul M + EA au fost pregătite pentru extracția ARN.

Pregătirea ARN și PCR cantitativă în timp real (q-PCR)

RNAiso Plus (TaKaRa Biotech. Co., Dalian, China) a fost utilizat pentru a extrage ARN-ul total conform protocolului producătorului. Toate probele de ARN au fost tratate cu DNază I (TaKaRa Biotech. Co., Dalian, China) și congelate la -80 ° C înainte de experimentul microarray de ADN. Cantitatea și puritatea ARN au fost evaluate utilizând NanoDrop ND-1000 (Criteriile de trecere pentru raporturile de absorbție sunt stabilite la A260/A280 ≥ 1,8 și A260/A230 ≥ 1,6). Valorile RIN sunt stabilite utilizând testul Agilent RNA 6000 Nano pentru a determina integritatea ARN (criteriile de trecere pentru valoarea RIN sunt stabilite la ≥ 7 indicând integritatea acceptabilă a ARN). Contaminarea ADNc a fost evaluată prin electroforeză pe gel.

First-catena cDNA a fost preparată de All-in-one First strand cDNA Synthesis Kit (Genecopeea, Guangzhou, China) urmând protocolul producătorului. Apoi, sistemul BIO-RAD CFX96 q-PCR (detectarea colorantului fluorescent SYBR Green I) a fost utilizat pentru a efectua qRT-PCR. Abundența de ARNm a fost normalizată cu gena de menaj β-actină, iar nivelurile relative de expresie au fost calculate utilizând metoda 2-ΔΔCt [30].