Departamentul de afiliere pentru știința sănătății mediului, Universitatea din Georgia, Atena, Georgia, Statele Unite ale Americii

potasiu

Departamentul de Afiliere pentru Științe și Inginerie a Mediului, Universitatea din Carolina de Nord la Chapel Hill, Chapel Hill, Carolina de Nord, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru știința sănătății mediului, Universitatea din Georgia, Atena, Georgia, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Afiliere pentru Științe și Inginerie a Mediului, Universitatea din Carolina de Nord la Chapel Hill, Chapel Hill, Carolina de Nord, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru sănătatea populației și patobiologie, Universitatea de Stat din Carolina de Nord, Raleigh, Carolina de Nord, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Afiliere pentru Științe și Inginerie a Mediului, Universitatea din Carolina de Nord la Chapel Hill, Chapel Hill, Carolina de Nord, Statele Unite ale Americii

  • Xiaoming Bian,
  • Liang Chi,
  • Bei Gao,
  • Pengcheng Tu,
  • Hongyu Ru,
  • Kun Lu

Cifre

Abstract

Citare: Bian X, Chi L, Gao B, Tu P, Ru H, Lu K (2017) Îndulcitorul artificial acesulfam de potasiu afectează microbiomul intestinal și creșterea în greutate corporală la șoarecii CD-1. PLoS ONE 12 (6): e0178426. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0178426

Editor: Mihai Covasa, Western University of Health Sciences, STATELE UNITE

Primit: 5 ianuarie 2017; Admis: 12 mai 2017; Publicat: 8 iunie 2017

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Universitatea din Georgia, Universitatea din Carolina de Nord și NIH/NIEHS (R01ES024950) au oferit sprijin financiar parțial pentru această lucrare.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Ca aditivi alimentari folosiți pe scară largă și înlocuitori ai zahărului, îndulcitorii artificiali pot îmbunătăți aroma și pot reduce simultan aportul de calorii. Unele studii epidemiologice au arătat că îndulcitorii artificiali sunt benefici pentru pierderea în greutate și pentru cei care suferă de intoleranță la glucoză și diabet zaharat de tip 2 [1]. Cu toate acestea, dovezile acumulate în ultimii ani sugerează că consumul de îndulcitor artificial ar putea perturba metabolismul uman, în special reglarea glucozei [2, 3]. S-a constatat că îndulcitorii artificiali provoacă intoleranță la glucoză și induc sindromul metabolic și sunt, de asemenea, asociați cu creșterea în greutate corporală mai mare [3-6]. Aceste descoperiri sugerează că îndulcitorii artificiali pot crește riscul de obezitate. Cu toate acestea, mecanismul specific prin care îndulcitorii artificiali disregulează metabolismul gazdei rămâne evaziv.

În acest studiu, am investigat efectele Ace-K asupra microbiomului intestinal și modificările metabolomului fecal folosind secvențierea ARNr 16S și metabolomica cromatografiei gazelor-spectrometrie de masă (GC-MS). Am constatat că consumul de Ace-K a perturbat microbiomul intestinal al șoarecilor CD-1 după un tratament de 4 săptămâni. Creșterea observată în greutate corporală, schimbările în compoziția comunității bacteriene intestinale, îmbogățirea genelor funcționale bacteriene și modificările metabolomice fecale au fost foarte dependente de sex. Mai exact, Ace-K a crescut creșterea în greutate corporală la șoarecii masculi, dar nu și la șoarecele femele. Genele funcționale implicate în metabolismul energetic au fost activate la șoareci masculi, dar inhibate la șoareci femele. Mai mult, s-au observat modificări diferențiale ale profilurilor metabolice fecale între animalele masculine și femele. Luate împreună, aceste rezultate pot oferi informații noi despre înțelegerea interacțiunii funcționale dintre îndulcitorii artificiali și microbiomul intestinal și rolul acestei interacțiuni în dezvoltarea obezității și a inflamației cronice.

Materiale și metode

Animale și expunere

Vechi de 7 săptămâni) au fost cumpărate de la Charles River și au furnizat o dietă standard de rozătoare peletată și apă de la robinet ad libitum în următoarele condiții de mediu: 22 ° C, 40-70% umiditate și un ciclu de lumină: întuneric de 12: 12 ore. Toți cei 20 de șoareci (10 bărbați și 10 femele) au fost găzduiți în instalația pentru animale de la Universitatea din Georgia timp de o săptămână înainte de experimentare. Apoi, șoarecii au fost repartizați aleatoriu în grupurile de control și Ace-K (cinci șoareci masculi și cinci femele din fiecare grup). Apă (martor) și îndulcitori artificiali au fost administrați șoarecilor (

De 8 săptămâni) prin gavaj timp de 4 săptămâni, cu doza de 37,5 mg/kg greutate corporală/zi. Această doză a fost echivalentă sau mult mai mică decât cele utilizate în studiile anterioare pe animale [20, 30]. Greutatea corporală a fost măsurată înainte și după tratament. Nu a existat nicio diferență statistică în greutatea corporală inițială între grupul martor și grupul Ace-K pentru șoareci masculi sau femele (masculi: 26,8 ± 1,1 g și 26,4 ± 1,1 g pentru grupul martor și Ace-K; femele: 22,8 ± 1,6 g și 22,4 ± 1,1 g pentru grupul de control și Ace-K). Șoarecii au fost eutanasiați cu CO2 într-o cameră adecvată de către personal instruit. Toate experimentele au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Georgia. Animalele au fost tratate uman și în ceea ce privește ameliorarea suferinței.

Secvențierea genei ARNr 16S

ADN-ul a fost izolat din pelete fecale înghețate colectate în diferite momente de timp folosind un kit PowerSoil ADN de izolare (Mo Bio Laboratories) conform instrucțiunilor producătorului, iar ADN-ul rezultat a fost cuantificat și stocat la -80 ° C pentru o analiză ulterioară. ADN purificat (1 ng) a fost utilizat pentru a amplifica regiunea V4 a ARNr-ului 16S al bacteriilor folosind primerii universali 515 (5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) și 806 (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT). Probele individuale au fost codate în bare, combinate pentru a construi o bibliotecă de secvențiere și apoi secvențiate de Illumina MiSeq la Georgia Genomics Facility pentru a genera 250-250 (PE250, v2 kit) citire la o adâncime de cel puțin 25.000 de citiri pe probă. Fișierele FASTQ asociate cu materiile prime au fost combinate și filtrate de calitate folosind Geneious 8.0.5 (Biomatters, Auckland, Noua Zeelandă), cu limita de probabilitate de eroare stabilită la 0,01. Datele au fost apoi analizate utilizând informații cantitative asupra ecologiei microbiene (QIIME, versiunea 1.9.1). UCLUST a fost utilizat pentru obținerea unităților taxonomice operaționale (OTU) cu 97% similaritate de secvență. Datele au fost atribuite la cinci niveluri diferite: filum, clasă, ordine, familie și gen.

Analiza funcțională de îmbogățire a genelor

Investigația filogenetică a comunităților prin reconstrucția statelor neobservate (PICRUSt) (versiunea Galaxy 1.0.0) a fost folosită pentru prima dată pentru a analiza îmbogățirea genelor funcționale din microbiomul intestinal al fiecărui grup [31]. PICRUSt poate profila cu precizie genele funcționale ale comunităților bacteriene pe baza genelor marker din datele de secvențiere 16S și a unei baze de date cu genomi de referință [32-34]. PICRUSt a fost utilizat pe scară largă în analiza îmbogățirii genelor funcționale a microbiomului, cu

S-a raportat o precizie de 95% pentru metagenomii bacterieni [32-34]. Rezultatele din PICRUSt au fost apoi importate în pachetul Analiza statistică a profilurilor metagenomice (STAMP) (versiunea 2.1.3) pentru analize și vizualizări statistice suplimentare [35].

Analiza metabolomică

Metaboliții au fost extrasați din probe fecale folosind metanol și cloroform așa cum s-a descris anterior [16]. Pe scurt, 20 mg de fecale au fost vortexate cu 1 ml de metanol/cloroform/soluție de apă (2: 2: 1) timp de 1 oră, urmată de centrifugare la 3.200 x g timp de 15 minute. Fazele superioare și inferioare rezultate au fost transferate într-un flacon de cromatografie cu gaz (GC), uscate timp de aproximativ 4 ore într-un SpeedVac și derivate folosind N, O-Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamidă (BSTFA). Un sistem GC-MS Agilent 6890/5973 echipat cu o coloană DB-5ms (Agilent, Santa Clara, CA) a fost utilizat pentru a efectua profilarea metabolomică și a capta toate caracteristicile detectabile ale metabolitului într-un interval de masă de la 50 la 600 m/z. Instrumentul online XCMS a fost utilizat pentru a identifica și alinia vârfurile și pentru a calcula intensitatea vârfului acumulat.

analize statistice

Diferența dintre microbiota intestinală individuală între ziua 0 și săptămâna 4 a fost evaluată utilizând software-ul mothur [36]. O hartă de căldură a fost utilizată pentru a vizualiza gruparea de gene funcționale îmbogățite. Un test t Welch cu două cozi (p Fig. 1. Efectele a patru săptămâni de consum Ace-K asupra creșterii în greutate corporală și a compoziției microbiomului intestinal al șoarecilor CD-1.

(A) Creșterea în greutate corporală a șoarecilor masculi tratați cu Ace-K a fost semnificativ mai mare decât cea a șoarecilor masculi de control, în timp ce creșterea în greutate corporală a șoarecilor femele nu a fost semnificativ diferită de cea a martorilor. (B) Consumul de Ace-K a modificat compoziția bacteriilor intestinale la șoarecii femele. Abundențele de Lactobacillus, Clostridium, un gen Ruminococcaceae neatribuit și un gen Oxalobacteraceae neatribuit au fost semnificativ scăzute, iar abundența Mucispirillum a fost crescută după consumul de Ace-K. (C) Consumul de Ace-K a modificat compoziția bacteriilor intestinale la șoarecii masculi. Abundențele de Bacteroides, Anaerostipes și Sutterella au fost semnificativ crescute după consumul Ace-K (* p 0,05).

2. Ace-K a modificat componentele microbiomului intestinal într-o manieră specifică genului

Având în vedere că Ace-K a indus creșterea în greutate corporală dependentă de gen la animale și având în vedere rolul crucial al bacteriilor intestinale în homeostazia energiei gazdei, am explorat în continuare dacă Ace-K are efecte diferite asupra microbiotei intestinale a șoarecilor masculi și femele. Fig. 1B și 1C arată genurile de bacterii intestinale care au fost modificate semnificativ (p Fig. 2. Analiza funcțională de îmbogățire a genelor care arată că genele funcționale legate de metabolismul carbohidraților au fost semnificativ reduse la șoarecii femele tratați cu Ace-K (p Fig. 3. Îmbogățirea funcțională a genei analiza arătând că genele funcționale legate de metabolismul carbohidraților au fost semnificativ crescute la șoarecii masculi tratați cu Ace-K (p Fig 4. Genele multiple care codifică mediatori proinflamatori au fost crescute semnificativ la șoarecii masculi și femele după consumul de Ace-K (p Fig 5. Consumul de Ace-K a schimbat metabolomul fecal al șoarecilor femele (A, B) și masculi (C, D), așa cum este ilustrat de cloud și de graficele PLS-DA.