Cordelia J. Barrick

și Departamentul de Genetică, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, NC 27599

b Curriculum în toxicologie, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, NC 27599

Ming Yu

și Departamentul de Genetică, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, NC 27599

c Program în biologie orală, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, NC 27599

Hann-Hsiang Chao

d Curriculum în genetică și biologie moleculară, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, NC 27599

David W. Threadgill

și Departamentul de Genetică, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, NC 27599

b Curriculum în toxicologie, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, NC 27599

c Program în biologie orală, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, NC 27599

d Curriculum în genetică și biologie moleculară, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, NC 27599

Abstract

Introducere

Receptorul factorului de creștere epidermic (EGFR) este membrul prototip al familiei ERBB a receptorilor tirozin kinaze, care include și ERBB2, ERBB3 și ERBB4 (Wells, 1999). Legarea ligandului induce homo- sau heterodimerizarea receptorilor cu fosforilarea ulterioară a reziduurilor de tirozină în coada carboxi-terminală creând site-uri de andocare care inițiază cascade de semnalizare intracelulară (Schlessinger, 2000). S-a estimat că semnalizarea crescută sau constitutivă prin EGFR apare în aproximativ o treime din toate neoplasmele umane; în plus, semnalizarea aberantă este asociată cu prognostic slab, inclusiv lipsa de răspuns la chimioterapia tradițională și scăderea supraviețuirii (Salomon și colab., 1995; Woodburn, 1999; Nicholson și colab., 2001).

De când EGFR a fost propus pentru prima dată ca țintă pentru medicamente împotriva cancerului în urmă cu aproape douăzeci de ani (Sato și colab., 1983; Gill și colab., 1984; Masui și colab., 1984), progresele în descoperirea medicamentelor au produs o mulțime de inhibitori care vizează receptor. În special, inhibitorii tirozin kinazei (TKI), care blochează activitatea EGFR prin concurența cu adenozin trifosfat (ATP) pentru legarea de buzunarul kinazei receptorului, au demonstrat eficacitate pentru mai multe tipuri de cancer (Jimeno și Hidalgo, 2006). Două TKI EGFR, Gefitinib/Iressa, (AstraZeneca) și Erlotinib/Tarceva, (OSI Pharmaceuticals), au primit aprobarea de reglementare pentru utilizarea la pacienții cu cancer, în timp ce alții sunt evaluați în cadrul studiilor clinice în curs ca terapii mono sau combinatorii (Marshall, 2006; Steeghs și colab., 2007). Odată cu pașii enormi care s-au făcut în terapia cancerului și creșterea rezultantă a speranței de viață după diagnosticare, anumite tipuri de cancer sunt acum percepute și tratate ca boli cronice, mai degrabă decât bolii terminale (Disis și Rivkin, 2003; Michener și Belinson, 2005; Markman, 2006; Burton și colab., 2007; Snyderman, 2007). Deși efectele secundare ale terapiilor vizate, cum ar fi TKI, sunt considerate ușoare în comparație cu chimioterapia tradițională, pacienții pot fi acum expuși acestor medicamente mai mulți ani decât luni. Cu toate acestea, nu se cunosc consecințele fiziologice pe termen lung ale activității suprimate a EGFR.

Materiale și metode

1) Animale și tratament farmacologic

Analiza tumorii intestinale

La vârsta de trei luni, șoarecii B6-Apc Min/+ au fost eutanasiați și au fost îndepărtate tractele gastrointestinale (GI) de la pilor la rect. Intestinul subțire a fost tăiat în treimi, iar cecul și colonul au fost separate. Segmentele au fost spălate ușor cu PBS pentru a îndepărta materialul fecal, tăiate longitudinal, așezate plat pe hârtie Whatmann 3MM și fixate peste noapte la 4 ° C în paraformaldehidă 4%. Polipii au fost numărați și diametrele lor măsurate folosind un microscop de disecție cu un micrometru în domeniu, permițând detectarea polipilor cu diametrul mai mare de 0,3 mm.

Ecocardiografie

Ecocardiografia transtoracică (TTE) a fost efectuată la momentul inițial și înainte de sacrificare folosind o sondă de 30 mHz pe un ultrasonograf Vevo 660 (VisualSonics). Șoarecii de tip sălbatic B6 au fost ușor anesteziați cu 1-1,5% izofluoran și un agent de depilare local aplicat înainte de plasarea în poziția decubit lateral stâng sub o lampă de căldură pentru a menține temperatura corpului la 37 ° C. Ritmul cardiac a fost menținut între 450 și 500 de bătăi pe minut. Au fost obținute vederi bidimensionale cu axe scurte și lungi ale ventriculului stâng. Urmăririle în modul M au fost înregistrate și utilizate pentru a determina diametrul end-diastolic al ventriculului stâng (LV), LVED, d), diametrul sistolic al LV (LVED, s), diastola LV a grosimii peretelui posterior (LVPWTh, d) și grosimea peretelui posterior al LV sistolică (LVPWTh, s) pe trei cicluri cardiace. Scurtarea fracțională LV a fost calculată utilizând formula% FS = (LVED, d-LVED, s)/(LVED, s). Toate măsurătorile au fost efectuate de doi observatori independenți orbi de grupul de tratament.

Histologie

Expresia genelor

ARN-ul total a fost extras din jumătatea inferioară a VS de la șoareci de tip sălbatic B6 folosind TRIzol (Invitrogen). După tratamentul ADNsei, 500 ng de ARN total au fost transcrise invers folosind trusa de arhivă ADNc de mare capacitate (Applied Biosystems). S-a determinat expresia markerilor de hipertrofie peptidă natriuretică atrială (Nppa) și peptidă natriuretică cerebrală (Nppb), markeri pro și anti-apoptotici (Bcl2l1, Bax și Bad) și receptori și liganzi ERBB (Egf, Nrg1, Dt, Erbb1 și Erbb2) prin PCR cantitativă în timp real (qPCR) folosind primerii și sondele Taqman Univeral Master Mix și Assays-on Demand (Applied Biosystems). Rezultatele sunt reprezentate ca modificări ale pliurilor medii în raport cu grupurile de control. Reacțiile au fost rulate pe o mașină Stratagene MX3000P cu software de analiză. Ciclurile prag (CT) au fost determinate de un algoritm din program care atribuie o linie de bază a fluorescenței pe baza citirilor anterioare amplificării exponențiale. Modificarea expresiei ori a fost calculată folosind metoda 2 -ΔΔcT (Livak și Schmittgen, 2001), cu Actb sau Gusb ca controale endogene.

Testele de fosforilare in vivo

Șoarecii masculi B6 de tip sălbatic (n = 2) menținuți pe dieta de control sau experimentală timp de 90 de zile au fost injectați subcutanat cu 5 μg/g greutate corporală de EGF (sisteme R&D) în PBS. După 10 minute, șoarecii au fost eutanasiați și ficății și inimile îndepărtați, congelați în azot lichid și depozitați la -80 ° C. Țesuturile înghețate au fost sonicate în 5-10 ml/g țesut tampon de liză format din 20 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 10 μg/ml de leupeptină, 10 μg/ml aprotinină, 1 mM vanadat de sodiu și 10 mM β-glicerofosfat la 4 ° C. Lizatele tisulare au fost eliminate prin centrifugare timp de 10 minute la 4 ° C și concentrațiile de proteine ​​au fost determinate prin testul Bradford (Bio-Rad). Lizatele proteice (15 μg pentru ficat și 30 μg pentru inimă) au fost separate prin denaturare cu electroforeză pe gel de poliacrilamidă dodecilsulfat de sodiu 7,5% (SDS-PAGE) și transferate în membranele PVDF (Bio-Rad). Pete de proteine ​​au fost incubate peste noapte la 4 ° C cu anticorpi policlonali de iepure care recunosc EGFR (RB-1417-P1, Labvision), fosfo-EGFR (Tyr1086) (36-9700, Zymed) sau fosfo-p44/42 MAP kinază (Thr202/Tyr204 ) (Semnalizare celulară) urmată de incubare cu anticorp conjugat de capră anti-iepure de hrean peroxidază (1858413, Pierce) și detectare cu un sistem de chemiluminesență îmbunătățit (Amersham Pharmacia/GE Healthcare).

analize statistice

Datele sunt prezentate ca medie +/- eroare standard a mediei (SEM). Datele din grupurile de control au fost reunite atunci când nu a existat nicio diferență semnificativă între parametri. Testul de parametru Wilcoxon non-parametric a fost utilizat pentru a compara numărul și dimensiunea tumorii între grupurile de tratament. Testul t al lui Mann-Whitney sau Student nepereche a fost folosit pentru a compara datele dintre grupurile de tratament și grupurile de control respective. Testul Kruskal-Wallis sau analiza varianței (ANOVA) a fost utilizat pentru a detecta semnificația prin tratament. Toate analizele au fost efectuate utilizând software-ul StatView (SAS). A p 3 H AG-1478 a arătat că distribuția țesuturilor este cea mai mare în ficat (Ellis și colab., 2006), care are, de asemenea, cel mai mare conținut total de proteine ​​fosfo-EGFR. Pentru a determina dacă expunerea dietetică cronică la AG-1478 suprimă activitatea EGFR, am examinat nivelurile totale și fosforilate de proteine ​​ale EGFR și ERK1/2 în lizatele hepatice de la șoareci B6 de tip sălbatic hrăniți fie cu control, fie cu diete care conțin AG-1478, timp de 90 de zile. Probele de ficat de la șoareci pe AG-1478 injectate cu 5 μg/g de greutate corporală EGF înainte de sacrificiu pentru a spori nivelurile de fosfo-EGFR au redus nivelurile de proteine ​​fosfo-EGFR și fosfo-ERK1/2 comparativ cu martorii (densitățile relative ale benzii au fost reduse cu 48% și, respectiv, 78%), deși nivelurile totale de proteine ​​EGFR au fost similare (Fig. 1).

farmacologică

Analiza imunoblot a lizatelor hepatice. Șoarecii masculi B6 de tip sălbatic au fost expuși la inhibitorul de molecule mici EGFR AG-1478 în dieta AIN 93G (AG-1478) sau dieta AIN 93G singură (martor) timp de trei luni (n = 2). (A) Western blots și (B) cuantificarea activării EGFR.

Rapoartele anterioare au demonstrat că expunerea alimentară la inhibitori ireversibili de molecule mici EGFR, cum ar fi EKB-569, a inhibat dramatic formarea polipului intestinal în modelul Apc Min/+ de șoarece al cancerului colorectal familial (Torrance și colab., 2000; Roberts și colab., 2002). Prin urmare, pentru a testa biologic și cantitativ livrarea orală de AG-1478, colegii B6-Apc Min/+ de ambele sexe au fost înțărcați pe chow care conțin AG-1478 (144 mg/kg) sau chow de control cu ​​hrănire ad libitum până la vârsta de 90 de zile după care li s-a îndepărtat tractul intestinal și s-a numărat numărul de tumori intestinale. AG-1478 a redus numărul polipilor cu 45% comparativ cu martorii (Tabelul 1), aproape identic cu cel raportat pentru un alt inhibitor reversibil EGFR EKI-785 (40 mg/kg/zi) în condiții experimentale similare (Torrance și colab., 2000), dar mai puțin de reducerea cu 87% a numărului de tumori raportată pentru EKB-569 (20 mg/kg/zi). Aceasta stabilește eficacitatea antitumorală a AG-1478 la șoarecii Apc Min/+ și demonstrează că livrarea orală în dietă este o cale eficientă.