Abstract

fundal

Pentru a investiga eficacitatea diferitelor tulpini probiotice, combinațiile și formele acestora (vii sau liofilizate) în prevenirea bolii hepatice grase nealcoolice (NAFLD).

Metode

Rezultate

Introducerea MSG în perioada neonatală duce la dezvoltarea NAFLD la șobolanii în vârstă de 4 luni. Pentru gradul de steatoză nu a existat nicio diferență semnificativă între grupul de obezitate MSG și grupurile de probiotice monocomponente liofilizate (III - V). Cea mai înaltă manifestare a steatozei a fost observată pentru B. animalis VKL (2,0 ± 0,25) în comparație cu B. animalis VKB (1,70 ± 0,21) și L. casei IMVB-7280 (1,80 ± 0,20). Modificările scorului steatozei între toate grupurile de monoprobiotice (III - V) au fost nesemnificative. Administrarea de la naștere atât a unui amestec probiotic viu (VII), cât și a unui liofilizat (VI) duce la o scădere semnificativă cu 69,5%p

fundal

Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) variază de la steatoza simplă la steatohepatita nealcoolică (NASH) care poate avea diferite grade de fibroză și poate evolua către ciroză hepatică și carcinom hepatocelular [1]. NAFLD care este asociat cu obezitatea și diabetul de tip 2 are o prevalență de 15-20% în populația generală și 76-90% în obezitate [2]. NAFLD este în prezent o cauză principală a bolilor hepatice cronice [3, 4], care au dus la probleme semnificative de sănătate, cum ar fi morbiditatea, mortalitatea și transplanturile de ficat [5].

Conform modelului de două lovituri al patogenezei NAFLD, rezistența la insulină ca primă lovitură, provoacă acumularea de lipide în hepatocite și duce la dezvoltarea ficatului gras. Al doilea hit include insulte celulare, cum ar fi stresul oxidativ și oxidarea lipidelor, care dăunează celulelor hepatice și declanșează un proces inflamator care duce la modificări patologice ale hepatocitelor care duc la NASH [6]. Studii recente prezintă o dovadă clară că microbiota intestinală este puternic implicată în patogeneza și progresia NAFLD prin mai multe mecanisme [7].

Mecanismele care stau la baza, care leagă compoziția modificată a microbiotei intestinale de NAFLD sunt modularea metabolismului colinei dietetice [8] și producerea de etanol endogen [9], permeabilitatea intestinală crescută [10] cu endotoxemie ulterioară și inflamație metabolică de grad scăzut [11], creșterea recoltarea de energie din dietă [12] și sinteza afectată a acizilor grași cu lanț scurt [13], absorbția scăzută a vitaminelor și a compușilor activi biologic [12], metabolismul modificat al acizilor biliari și semnalizarea FXR/TGR5 [14]. Prebioticele și probioticele au funcții fiziologice care contribuie la sănătatea microbiotei intestinale și/sau la refacerea microflorei, menținerea unei greutăți corporale sănătoase și controlul factorilor asociați cu NAFLD prin diferitele căi menționate mai sus [15].

În lucrările noastre anterioare, am arătat că tratamentul periodic cu biomasă care conține multiprobiotice a 14 tulpini vii (Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium, Propionibacterium, Acetobacter) previne, cel puțin parțial, obezitatea indusă de MSG [16] și dezvoltarea NAFLD [17]. Cu toate acestea, întrebarea privind eficacitatea diferitelor tulpini probiotice, combinația și forma acestora (vii sau liofilizate) în gestionarea NAFLD rămâne deschisă, ceea ce a format obiectivele studiului actual.

Metode

Animale

Acest studiu a fost realizat în strictă conformitate cu recomandările din Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator ale Institutelor Naționale de Sănătate și cu principiile etice generale ale experimentelor pe animale, aprobat de Primul Congres Național de Bioetică din Ucraina (septembrie 2001) . Protocolul a fost aprobat de Comitetul pentru etica experimentelor pe animale de la Universitatea Națională Taras Shevchenko din Kiev (numărul protocolului: 10/2014). Șobolanii au fost ținuți în cuști colective în condiții controlate de temperatură (22 ± 3 ° C), lumină (ciclu 12 ore lumină/întuneric) și umiditate relativă (60 ± 5%). Animalele au fost hrănite cu chow de laborator (PurinaW) și apă de la robinet ad libitum.

Proiectarea experimentelor

Studiul a inclus 70 de șobolani Wistar masculi împărțiți în 7 grupe, câte 10 animale în fiecare (Fig. 1). Șobolanii nou-născuți din grupul martor (I) au fost administrați cu soluție salină subcutanată (s.c.) în volumul de 8 μl/g la 2, 4, 6, 8 și 10 zile postnatale. Șobolanii nou-născuți din grupele II - VII au fost injectați cu soluție de glutamat monosodic (MSG) (4,0 mg/g greutate corporală) s.c. la 2, 4, 6, 8 și 10 zile postnatale [18]. Administrarea neonatală de MSG determină acumularea semnificativă de grăsime în abdomenul șobolanilor adulți. Acest lucru se întâmplă din cauza efectelor de neurotoxicitate asupra nucleelor ​​arcuate și ventromediale ale hipotalamusului [19]. În lucrările noastre anterioare, am arătat dezvoltarea NAFLD în condiții de obezitate viscerală severă indusă de MSG [17]. Astfel, rezultatele obținute au confirmat validitatea utilizării MSG pentru dezvoltarea NAFLD.

experimentală

Grupurile III - VII au fost tratate cu probiotice. Grupurile III-V au primit monoprobiotice liofilizate B. animalis VKL, B. animalis VKB, L. casei IMVB-7280 respectiv. Grupul VI a primit amestecul acestor trei tulpini probiotice. Grupul VII a fost tratat cu „Symbiter” multiprobiotic care a fost furnizat de către Compania Științifică și de Producție O.D. Prolisok ”. Conține 14 tulpini probiotice vii de Lactobacillus + Lactococ (6 × 10 10 UFC/g), Bifidobacterium (1 × 10 10/g), Propionibacterium (3 × 10 10/g), Acetobacter (1 × 10 6/g) genuri.

Administrarea a fost începută la sfârșitul celei de-a 4-a săptămâni după naștere și a continuat intermitent alternând un curs de 2 săptămâni și intervale de 2 săptămâni de netratare. În termen de 4 luni de la naștere, șobolanii urmau o dietă normală. Toți parametrii au fost măsurați la șobolani în vârstă de 4 luni.

Colectarea probelor și analiza biochimiei sângelui

Șobolanii din toate grupurile au fost postite timp de aproximativ 12 ore înainte de sacrificiu. Șobolanii au fost sacrificați prin luxație cervicală sub anestezie cu uretan. Sângele a fost extras din vârful ventriculului cardiac și puține picături de sânge au fost colectate într-un tub de microcentrifugă care conține un amestec de NaF și EDTA la un 2: 1 (w/w) raport. Proba de sânge a fost colectată într-un tub steril și centrifugată la 3500 rpm (2260 g) timp de 15 min. După centrifugare, supernatantul seric pentru analiză ulterioară a fost alicotat în tuburi de microcentrifugă și depozitat la -80 ° C. Bilirubina, activitatea alaninei și aspartatului aminotransferazei în ser a fost determinată prin metodele biochimice standard.

Evaluarea histologiei ficatului

Pentru analiza histologică au fost prelevate probe de țesut hepatic atât din lobul hepatic drept, cât și din cel stâng (dimensiunea probei 0,5 × 0,5 cm). După fixarea timp de 24 de ore într-un Buena lichid, fragmentele de ficat au fost deshidratate în alcool cu ​​concentrații crescânde (de la 70 la 96 °), încorporate în parafină și apoi tăiate cu o grosime de 5-6 microni și colorate cu hematoxilin-eozină. Un patolog orbit de distribuțiile de grup a efectuat analize histologice ale diapozitivelor folosind microscopie cu lumină (Olympus, Japonia). Pentru a evalua modificările morfologice ale ficatului am folosit NAS (scor de activitate NAFLD), care include trăsături histologice și a fost definit ca suma neponderată a scorurilor pentru steatoză (0-3), inflamație lobulară (0-3) și balonare (0-2) ).). Conform scorurilor NAS ≥5 sunt diagnosticate ca steatohepatită nealcoolică (NASH) și cazuri cu test NAS 2. Diferența dintre grupuri a fost definită ca fiind statistic semnificativă atunci când a p-valoarea a fost mai mică de 0,05.

Rezultate

Nu am găsit nicio diferență semnificativă în indicatorii biochimici (alanina transaminază (ALT), aspartat transaminază (AST), bilirubină) a ficatului din serul sanguin între grupul intact, obezitatea MSG și grupul probiotic MSG (Tabelul 1).

Modificările histologice ale ficatului, astfel cum sunt evaluate de scorul NAS, asociate cu administrarea diferitelor tipuri de probiotice, sunt reprezentate în tabelul 2. Pentru gradul de steatoză nu a existat nicio diferență semnificativă între grupul de obezitate MSG și grupurile de probiotice monocomponente liofilizate (III - V) (Fig. 2a-d). Cea mai înaltă manifestare a steatozei a fost observată pentru B. animalis VKL (2,0 ± 0,25) în comparație cu B. animalis VKB (1,70 ± 0,21) și L. casei IMVB-7280 (1,80 ± 0,20). Modificările scorului steatozei între toate grupurile de monoprobiotice (III - V) au fost nesemnificative. Administrarea de la naștere atât a unui amestec probiotic viu (VII), cât și a unui liofilizat (VI) duce la o scădere semnificativă cu 69,5%p Tabelul 2 Modificări morfologice în ficatul șobolanului evaluate prin scorul de activitate NAFLD (NAS)

Micrografii microscopice ușoare ale țesutului hepatic de șobolan colorate cu hematoxilină și eozină, × 400. În micrografii s-au observat preponderent steatoza totală pronunțată microvesiculară. A - Grupul de obezitate indus de MSG; b - B. animalis Grup VKL; c - B. animalis Grup VKB; d - L. casei Grupul IMVB-7280

Micrografii microscopice ușoare ale țesutului hepatic de șobolan colorate cu hematoxilină și eozină, × 400. În micrografiile focale s-a observat în principal steatoza microvesiculară ușoară. A - Grupul de poliprobiotice; b - Grupul Symbiter

Similar cu modificările scorului steatozei, am constatat că administrarea atât a amestecurilor probiotice vii, cât și a celor liofilizate din săptămâna a 4-a după naștere duc la o reducere semnificativă a manifestării inflamației hepatice în perioada de maturitate la șobolani, în comparație cu colegii de litiere cu obezitate indusă de MSG. În secțiunile de histologie hepatică au fost observate leziuni specifice NASH. Mai exact, inflamația a fost ușoară și predominant lobulară mai degrabă decât portală, cu infiltrate tipic mixte, care au inclus fenotipuri de celule inflamatorii cronice, cum ar fi limfocite, monocite (Fig. 4a-d). Nu s-au găsit modificări semnificative ale inflamației lobulare, evaluate prin scorul NAS între grupul obezității indus de MSG și grupurile probiotice monocomponente liofilizate (III - V). Cele mai proeminente schimbări din toate grupurile liofilizate au fost descrise pentru B. animalis VKL. Numai în acest grup am diagnosticat NASH la 10% dintre animale care a fost semnificativ (p = 0,026) în comparație cu grupul MSG-obezitate cu 30% din animalele cu NASH. Toate grupurile au fost de obicei relative în prezentarea histologică a degenerării cu baloane datorită absenței oricărei diferențe semnificative (p > 0,05) (Tabelul 2).

Micrografii microscopice ușoare ale țesutului hepatic de șobolan colorate cu hematoxilină și eozină, × 400. În micrografii steatoza microvesiculară cu infiltrare perivasculară de leucocite în zona 3 (inflamație lobulară ușoară) (c, d) și necroză focală ca urmare a degenerării cu balonare a hepatocitelor - lipsa nucleelor ​​(în centru) (A, b) a fost observat. A - Grupul de obezitate indus de MSG; b - B. animalis Grup VKL; c - B. animalis Grup VKB; d - L. casei Grupul IMVB-7280

Cel mai mic scor total NAS a fost observat după administrarea unui grup multiprobiotic viu (0,8 ± 0,2), care au fost nesemnificative la șobolanii martor și statistic mai mici în comparație cu toate grupurile monoprobiotice (III - V). Când s-a utilizat amestecul probiotic liofilizat (VI), modificările scorului NAS total între celelalte tratate au fost nesemnificative.

În paralel cu îmbunătățirea scorului NAS total pentru ambele amestecuri de probiotice polcomponente, am observat o scădere semnificativă a conținutului total de lipide și trigliceride în ficat cu aproximativ 22-25%, respectiv, în comparație cu grupul MSG-obezitate (Fig. 5a și b). După administrarea de probiotice monocomponente liofilizate (grupele III - V) modificările cantității de lipide hepatice au fost nesemnificative.

Discuţie

Studiul nostru a arătat în mod concludent că cursurile pe termen scurt de amestecuri de probiotice de la naștere au un efect preventiv asupra dezvoltării bolilor hepatice grase în condiția obezității induse de MSG. Cu toate acestea, potențialul terapeutic este mai pronunțat pentru amestecul probiotic multistrain viu (VII), deoarece numai pentru grupul Symbiter au fost detectate un grad semnificativ mai scăzut de steatoză și scorul total NAS în comparație cu grupurile de probiotice monocomponente (III - V) și orice modificări semnificative ale parametrilor de evaluare a histologiei ficatului nu au fost găsite comparativ cu șobolanii intacti.

În special, diferit Lactobacillus și Bifidobacterium tulpinile au efecte specifice asupra markerilor obezității la modelele de rozătoare. Analiza datelor din literatura publicată din ianuarie 2013 până în iulie 2014 de Cani și colab. a arătat că cel puțin 15 tulpini diferite de Lactobacillus și 3 tulpini de Bifidobacterium nu influențează în mod egal lipidele hepatice și dezvoltarea NAFLD în diferite modele animale. În mod remarcabil, 12 tulpini au scăzut inflamația țesutului hepatic și 11 au redus conținutul de trigliceride hepatice atunci când au fost administrate ca tratament unic [22].

Spre deosebire de studiul nostru, în care nu am observat modificări semnificative specifice unei singure tulpini în metabolismul lipidelor și dezvoltarea NAFLD, un studiu recent a comparat efectele a patru Bifidobacterii tulpini (Bifidobacterii L66-5, L75-4, M13-4 și FS31-12) privind metabolismul lipidic la șoareci obezi cu o dietă bogată în grăsimi. Toate cele patru tulpini ar putea reduce trigliceridele serice și hepatice și pot atenua semnificativ depunerea lipidelor în ficat. Cât despre colesterolul total Bifidobacterii L66-5 și Bifidobacterii FS31-12 și-a redus semnificativ cantitatea în ficat [23].

Administrarea probioticului cu o singură tulpină de Lactobacillus rhamnosus GG protejează șoarecii de dezvoltarea NAFLD indusă de o dietă bogată în fructoză printr-o creștere a bacteriilor benefice, restabilirea funcției de barieră intestinală și atenuarea ulterioară a inflamației hepatice și a steatozei [24]. Un alt studiu a demonstrat că tratamentul cu Lactobacillus rhamnosus GG timp de 13 săptămâni, în condițiile unei diete bogate în grăsimi, îmbunătățirea sensibilității la insulină și reducerea acumulării de lipide prin stimularea secreției de adiponectină și, prin urmare, activarea AMPK [25].

În plus, sa raportat că o suplimentare orală de Bifidobacterium adolescentis (5 × 10 (7) CFU/ml) ad libitum timp de 12 săptămâni protejat împotriva unui NASH indus de dietă la șoareci C57BL/6. Mai mult, șoarecii tratați cu probiotice au redus semnificativ leziunile hepatice, care au fost asociate cu prevenirea peroxidării lipidelor, activarea NFκB și, în cele din urmă, a inflamației în ficat [26].

Pe de altă parte, datele noastre găsesc sprijin într-un alt studiu recent care a stabilit că probioticele cu o singură tulpină ale Lactobacillus curvatus HY7601 a redus semnificativ acumularea de grăsimi hepatice în comparație cu Lactobacillus plantarum KY1032 în obezitatea indusă de dietă. Combinația acestui probiotic a fost mai eficientă pentru inhibarea expresiilor genetice ale diferitelor enzime responsabile de sinteza acizilor grași în ficat, concomitent cu scăderea activităților enzimei legate de oxidarea acizilor grași și a expresiilor lor genetice [27].

Plaza-Diaz la șobolanii Zucker cu obezitate determinată genetic au evaluat efectele Lactobacillus paracasei CNCM I-4034, Bifidobacterium breve CNCM I-4035 și Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 tulpini probiotice și amestecul lor pe dezvoltarea steatozei hepatice în comparație cu placebo. În acest studiu, numai probioticul cu o singură tulpină de Lactobacillus rhamnosus sau Bifidobacterium breve și amestecul de Bifidobacterium breve și Lactobacillus paracasei scăderea conținutului de triacilglicerol în ficatul de șobolan și reducerea manifestării parțiale a steatozei hepatice prin reducerea LPS seric [28].

S-a aruncat o oarecare lumină asupra mecanismelor care stau la baza impactului probiotic. Se știe că bacteriile simbiotice pot produce acizi grași cu lanț scurt, de ex. butirat. Această substanță inhibă activarea cascadelor de semnalizare dependente de receptor de tip toll (TLR) în ficat prin consolidarea joncțiunii etanșe intestinale și reducerea translocației endotoxinei bacteriene în ficat, care a fost arătată pe modelul NAFLD indus de dietă în stil occidental [ 30]. S-a stabilit că butiratul a împiedicat peroxidarea lipidelor prin reducerea nivelului de aductivi ai proteinelor 4-hidroxinonenale și reglează în jos nivelul sintazei de oxid nitric inductibil, care este esențială pentru reglarea nu numai a cascadelor de semnalizare în funcție de NF-κB în dezvoltarea NAFLD, ci și pentru exprimarea TLR -4 genă de răspuns primar de diferențiere a proteinei mieloide 88. Astfel, producția de butirat are ca rezultat atenuarea inflamației și semnalizarea dependentă de TLR în ficat în condiții experimentale NAFLD [30].

Concluzii

Administrarea postnatală atât a amestecului de probiotice vii (VII) cât și liofilizate (VI) duce la o scădere semnificativă a steatozei hepatice, a conținutului total de lipide și trigliceride în ficat în comparație cu obezitatea MSG și poate fi mai benefică decât probioticele cu o singură tulpină. Astfel, probioticele multicomponente au un efect preventiv asupra dezvoltării bolilor hepatice grase. Poate fi legat de o viabilitate mai pronunțată a tulpinilor vii și de prevenirea translocației bacteriene. Multistrain sau multispecii au format interacțiuni mutualiste în amestecuri și, prin urmare, au fost capabili să se împărtășească cu diferiți metaboliți, afectează receptori diferiți și au produs diverși compuși biologic activi. Deci, efectul lor sinergic general este mai mare decât suma efectelor lor individuale. Pe de altă parte, cel mai probabil datorită diferitelor mecanisme putative de acțiune, probiotice specifice tulpinii trebuie luate în considerare pentru o nouă investigație în diferite boli metabolice.