Abstract

Expresia genei de dezvoltare a lipazei pancreatice (PL) și a proteinelor sale conexe (PLRP1 și PLRP2) este anticoordonată. Nu se știe dacă grăsimile din dietă reglează expresia acestor proteine ​​în etapa de preînțărcare. Pentru determinarea reglării dezvoltării și a dietei pe PL, PLRP1 și PLRP2 încă din perioada de alăptare, șobolanii însărcinați (Sprague-Dawley) au consumat din ziua 15 (d15) de sarcină până la d9 de lactație un nivel pur purificat (11% din energie) ) dieta cu ulei de șofrănel [cu conținut scăzut de grăsimi (LF)]. De la d9 de lactație, barajele și puii lor respectivi au fost hrăniți cu diete cu ulei de șofrănel cu conținut scăzut de grăsimi (MF; 40% din energie) sau cu conținut ridicat de grăsimi (HF; 67% din energie) până la d56. Conținutul de acizi grași din lapte a avut de 15 până la 100 de ori mai puțin C: 10 și de 2,6 până la 3,3 ori mai mult C18: 2 în grupurile MF și HF. Dieta (LF d21> d28). Raportat pentru prima dată este reglarea semnificativă a nivelurilor de ARNm de PLRP2 de către grăsimile polinesaturate ridicate la șobolanii care alăptează (d15). În concluzie, expresia genelor PL și PLRP2 este reglată anticoordonat de cantitatea de grăsimi polinesaturate din dietă începând încă din faza de preînțărcare a dezvoltării.

Grăsimea alimentară furnizează cea mai mare energie (∼ 50% calorii) în timpul copilăriei în laptele matern și formulele (1). În ultimul deceniu, sa acordat o atenție specială tipului de grăsime necesară dezvoltării normale a sugarului, în special acizilor grași polinesaturați cu lanț lung (PUFA). PUFA derivat din acizi grași esențiali (C18: 2, acid linoleic și C18: 3α-linolenic) joacă un rol cheie în creier și dezvoltarea normală a retinei (2).

Digestia și absorbția grăsimilor la sugar și la nou-născutul prematur depind de modelul de dezvoltare al lipazelor (3). Sistemul digestiv continuă să se dezvolte după naștere la sugari și mai ales la nou-născuții prematuri, influențând capacitatea lor de a digera grăsimile. Lipaza gastrică, care începe digestia grăsimilor din dietă și reprezintă 10-30% din digestia grăsimilor (4), lipaza pancreatică dependentă de colipază și sarea biliară din lapte - lipaza stimulată are toate roluri potențiale în digestia grăsimii din lapte la nou-născut ( 3). Proteina 2 legată de lipaza pancreatică (PLRP2) poate juca și un rol în digestia grăsimilor neonatale (5). Deși nivelurile de lipază pancreatică la nou-născut și cu atât mai mult la sugarul prematur sunt scăzute, digestia grăsimii din lapte depinde de aceste patru lipaze cu funcții unice și doar parțial suprapuse (5-7).

Pancreasul exocrin sintetizează și secretă lipaza pancreatică și două proteine ​​legate de lipaza pancreatică; PLRP1 și PLRP2. PL și proteinele sale conexe au fost identificate la oameni și șobolani. PLRP1 este foarte omolog cu PL cu reziduuri conservate de serină și histidină în situsul activ (8,9); cu toate acestea, această proteină nu prezintă activitate lipolitică dependentă de colipază atunci când ADNc-ul său de lungime completă este exprimat în celule COS sau Sf9 (8,9). Deși PLRP1 este secretat de pancreasul exocrin la mai multe specii (10), funcția PLRP1 rămâne necunoscută. Trei rapoarte (11-13) au sugerat că două mutații ale reziduurilor 179 și 181 (alanină și prolină la valină și, respectiv, alanină) fac PLRP1 inactiv. A doua proteină înrudită (PLRP2) prezintă proprietăți lipolitice diferite de PL. Chiar dacă PLRP2 are o activare limitată de colipază în prezența sărurilor biliare, PLRP2 are o activitate lipolitică considerabilă în absența colipazei și are atât activități de fosfolipază, cât și de galactolipază (14).

Modelul de dezvoltare postnatală a PL și proteinele sale conexe este anticoordonat la om și șobolan (9,15). Nivelurile de ARNm ale PLRP1 și PLRP2 sunt ridicate în faza numai alăptării (zilele 0-14), scad în faza alăptării-ronțăit (zilele 14-21) și sunt scăzute pe tot parcursul înțărcării și la maturitate (21 zile și mai târziu). În schimb, PL nu este exprimat la niveluri detectabile până la ziua 14 postnatală (d14), iar expresia sa crește pe parcursul fazelor de alăptare-ronțăit și înțărcare la niveluri maxime la vârsta adultă. S-a propus că expresia anticoordonată a PL și a proteinelor sale conexe poate reflecta roluri diferite în digestia lipidelor în timpul dezvoltării postnatale (9). Susținând propunerea lor, Lowe și colab. (5) au constatat o scădere a absorbției și digestiei neonatale a grăsimilor din dietă la șoarecii knockout PLRP2.

PL este principala enzimă responsabilă de digestia trigliceridelor dietetice în perioada înțărcată și adultă (4). În prezența colipazei și a sărurilor biliare, PL hidrolizează trigliceridele dietetice din intestinul subțire în două - monogliceride și acizi grași liberi (FFA) - care sunt apoi absorbiți. Atât oamenii, cât și șobolanii adaptează sinteza lipazei pancreatice ca răspuns la variațiile dietetice și astfel maximizează utilizarea grăsimilor din dietă (16). S-a demonstrat importanța fiziologică a acestei reglementări dietetice. Reglarea în sus a PL îmbunătățește răspunsul colecistochininei la creșterea grăsimilor alimentare prin creșterea ratei de digestie a trigliceridelor și a eliberării de FFA în intestinul subțire proximal (17). La animalele înțărcate, PL și PLRP1 se adaptează la creșterea grăsimilor alimentare (41-75% din energia totală) în decurs de 24 de ore. După 5 zile, PL și PLRP1 ating niveluri mai ridicate de activitate și sinteză PL și PLRP1 mRNA (16-22).

Reglarea PL și PLRP1 în funcție de tipul de grăsime (lungimea lanțului și gradul de saturație) este controversată. Am arătat anterior că PL este reglementată în mod similar de diferite tipuri de grăsime peste un prag de 49% din energie ca grăsime (21) și că grăsimile foarte polinesaturate și bogate în trigliceride cu lanț mediu stimulează reglarea genei PL sub acel prag (20) . Nu se știe dacă expresia genică a PL, PLRP1 și PLRP2 este modificată de grăsimea alimentară în faza de alăptare, atunci când puii consumă numai lapte matern sau în faza de dezvoltare a alăptării, când puii consumă atât lapte matern, cât și dieta maternă.

Compoziția de acizi grași a laptelui matern poate fi modificată prin modificarea cantității de grăsimi polinesaturate din dieta barajului care alăptează (23-25). Scopul acestui studiu a fost de a determina dacă cantitatea de grăsimi dietetice polinesaturate poate regla PL, PLRP1 și PLRP2 în timpul dezvoltării, incluzând doar fazele de alăptare, sugare-alăptare, înțărcare și adulți și de a determina dacă există o interacțiune a acestei diete reglarea cu reglarea dezvoltării PL și a proteinelor sale conexe atunci când PUFA sunt introduse încă din epoca de preînțelegere.

METODE

Protocol experimental.

Consumul de alimente a fost măsurat zilnic. Greutățile corpului puilor au fost măsurate la d9, d15, d21, d28 și d56 din experiment atunci când puii masculi selectați au fost uciși prin inhalarea CO2. Mărimea eșantionului a variat de la 6 la 12 per grup pe d15-56 din cauza variației numărului de pui de sex masculin pe baraj, care a limitat eșantionarea în unele zile. O dimensiune minimă a eșantionului de 5 șobolani a fost estimată prin analiza puterii pentru a detecta o modificare de 50% a nivelurilor de ARNm PL și PLRP1 cu o varianță a populației de 30% pentru PL și PLRP1. Datorită dimensiunii pancreatice mici pe d9, puii au fost prelevați fie pentru activitatea ARNm PL, fie pentru activitatea PL. Astfel, dimensiunea eșantionului pentru greutatea corporală și greutatea pancreatică este mai mare (n = 20) decât pentru activitatea PL mARN sau PL. Pentru d15 și mai târziu, dimensiunea pancreatică a fost suficient de mare încât o porțiune din fiecare pancreas să fie înghețată imediat pe gheață uscată și stocată la -80 ° C pentru analiza enzimei. Restul pancreasului a fost utilizat imediat pentru izolarea ARN, așa cum este descris mai jos.

Analiza acizilor grași.

La 50 L de probe de lapte combinate pentru fiecare tratament, s-au adăugat 30 g de C: 17 FFA, 500 L de benzen și 3 L de acetilclorură: MeOH (1:15) (27). (Din cauza volumelor mici de lapte, a fost necesară colectarea probelor pentru un volum suficient pentru analiză.) Probele au fost incubate într-o baie de apă la 65 ° C timp de 2 ore. După răcire, s-au adăugat 10 g de ester metilic al acidului gras C: 15, standard intern, 500 μl de hexan și 1 L de H2O, iar probele au fost centrifugate pentru a se separa. Stratul de hexan a fost preluat și injectat în cromatograful gazos pentru analiza acizilor grași (27).

Analiza enzimei pancreatice.

Fragmentele pancreatice au fost omogenizate în 9 volți de PBS (0,15 M NaCl, 5 mM PO4, pH 7,4) cu un omogenizator Polytron. Omogenatele au fost centrifugate la 14.000 μg la 4 ° C timp de 30 min. Supernatantul a fost îndepărtat și s-a adăugat inhibitor de tripsină din soia (concentrație finală, 0,01%). Supernatantul a fost utilizat pentru a determina activitatea enzimei și conținutul de proteine. Activitatea lipazei a fost testată printr-o metodă titrimerică (21) cu 20 mM NaOH utilizând o emulsie gumă arabică stabilizată de trioleină neutralizată cu exces de colipază brută. Proteina a fost determinată prin metoda Lowry și colab. (28), utilizând albumina bovină ca standard. Activitățile enzimatice au fost exprimate ca niște (micro-moli de acid gras eliberat pe minut) pe miligram de proteine.

Studii de extracție și hibridizare a ARN-ului.

Analiza datelor.

Toate datele, exprimate ca medie ± SE, au fost analizate prin ANOVA bidirecțional (34) pentru efectele independente ale 1) dietă, 2) dezvoltarea și 3) efectele de interacțiune ale dietei × dezvoltarea. Datele pentru d9 nu au fost incluse în ANOVA bidirecțională, deoarece doar grupul LF a fost eșantionat în acest moment. Media pentru d9 LF este prezentată pentru comparație. Rezultatele au fost considerate semnificativ diferite dacă P

REZULTATE

Compoziția acidului gras din lapte.

Compoziția de acizi grași din lapte la d15 de lactație de la șobolani care au consumat diete de ulei de șofrănel LF (11%), MF (40%) și HF (67%) este prezentată în Tabelul 2. Cantitatea de ulei de șofră din dietă a modificat grăsimea din lapte conținut de acid cu C10: 00 de 15 până la 100 de ori și C18: 2 de 2,6 până la 3,3 ori în laptele șobolanilor care alăptează care au consumat diete de ulei de șofrănel MF și respectiv HF, comparativ cu șobolanii care alăptează care au consumat dieta cu ulei de șofrănel LF. Această modificare a dus la o creștere atât a raportului lanț lung/lanț mediu de la 2,8 pentru LF la 72,5 pentru HF și a raportului polinesaturat/saturat (P/S) de la 0,38 pentru LF la 5,6 pentru HF.

Greutatea corporală finală.

A existat un efect independent semnificativ al dietei (LF = MF> HF; P figura 1

pancreatică

Greutatea corporală finală a șobolanilor care au consumat LF (11% ca energie; (), MF (40% ca energie; ▪) și HF (67% ca energie; □) diete cu ulei de șofrănel. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SE. Orice bare fără SE vizibilă avea SE mai mică decât cea mai mică unitate din grafic. A existat un efect independent al dietei (LF = MF> HF; P dieta a, b care nu împărtășește un supercript a diferit semnificativ) și de dezvoltare (d15 c - f zilele care nu au un supercript au diferit semnificativ). Nu a existat nicio interacțiune semnificativă între dieta × dezvoltarea. Numărul puilor de sex masculin pe probă a fost de 9 zile (20 pe grup), 15 zile (9-10 pe grup), 21 zile (7-11 pe grup), 28 zile (6-9 pe grup) și 56 zile 8 –12 per grup).

Consum de mâncare.

Consumul mediu de alimente pe zi a fost măsurat la șobolani în vârstă de 28 și 56 de d, după ce au fost înțărcați. A existat un efect semnificativ independent al dietei (LF Tabelul 3 Consumul alimentar al șobolanilor care au consumat diete cu ulei de șofrănel LF, MF sau HF

Activitatea lipazei pancreatice.

A existat un efect semnificativ independent al dietei (LF Figura 2

Activitatea lipazei pancreatice (U/mg de proteină) la șobolanii care au consumat LF (11% ca energie; □), MF (40% ca energie; ▪) și HF (67% ca energie; □) diete cu ulei de șofrănel. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SE. Orice bare fără SE vizibilă avea SE mai mică decât cea mai mică unitate din grafic. A existat un efect independent al dietei (dieta LF a, b care nu împărtășea un supercript a diferit semnificativ) și de dezvoltare (d15 c - e zile care nu au împărțit un supercript au diferit semnificativ). A existat o interacțiune semnificativă între dieta × dezvoltarea (P valorile f - k care nu partajează un supercript au diferit semnificativ). Numărul de pui de sex masculin pe eșantion a fost de 9 d (9 pe grup), 15 d (7-10 pe grup), 21 d (7-10 pe grup), 28 d (6-9 pe grup) și 56 d 6 –12 per grup).

Niveluri de ARNm PL.

Au existat efecte independente semnificative ale dietei (LF 56d> 21d> 15d; P Figura 3

Raportul ARNm/S28 al lipazei pancreatice la șobolanii care au consumat LF (11% ca energie; □), MF (40% ca energie; ▪) și HF (67% ca energie; □) diete cu ulei de șofrănel. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SE. Orice bare fără SE vizibilă avea SE mai mică decât cea mai mică unitate din grafic. A existat un efect independent al dietei (dieta LF a, b care nu împărtășea un supercript a diferit semnificativ) și de dezvoltare (d15 c - f zilele care nu au împărțit un supercript au diferit semnificativ). Numărul puilor de sex masculin pe eșantion a fost de 9 zile (12 pe grup), 15 zile (7-10 pe grup), 21 zile (6 pe grup), 28 zile (6-9 pe grup) și 56 zile 12 pe grup ). de ARNm PLRP în jurul nașterii sugerează că acestea pot juca un rol important în faza de alăptare și alăptare, când șobolanul consumă lapte matern și dieta maternă.

Niveluri de ARNm PLRP1.

A existat un efect semnificativ independent al dezvoltării (15d = 21d> 28d> 56d; P Figura 4

Raport PLRP1 mARN/S28 al șobolanilor care au consumat LF (11% ca energie; □), MF (40% ca energie; ▪) și HF (67% ca energie; □) diete cu ulei de șofrănel. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SE. Orice bare fără SE vizibilă avea SE mai mică decât cea mai mică unitate din grafic. A existat un efect independent al dezvoltării (zilele d56 a - c care nu împărtășeau un supercript au diferit semnificativ). Nu a existat un efect semnificativ al dietei și interacțiunea cu dieta × dezvoltarea. Numărul de pui de sex masculin pe eșantion a fost de 9 zile (15 pe grup), 15 zile (7-10 pe grup), 21 zile (6 pe grup), 28 zile (6-8 pe grup) și 56 zile 11 pe grup ).

Niveluri de ARNm PLRP2.

Raportăm pentru prima dată un efect semnificativ independent al dietei asupra reglării PLRP2 (P 21d; P Figura 5

Raport PLRP2 mARN/S28 al șobolanilor care au consumat LF (11% ca energie; □), MF (40% ca energie; ▪) și HF (67% ca energie; □) diete cu ulei de șofrănel. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SE. Orice bare fără SE vizibilă avea SE mai mică decât cea mai mică unitate din grafic. A existat un efect independent al dietei (LF = MF> HF; P dieta a, b care nu împărtășește un supercript a diferit semnificativ) și de dezvoltare (d21 c - d zile care nu au un supercript au diferit semnificativ). A existat o interacțiune semnificativă între dieta × dezvoltarea (P Valorile e - g care nu partajează un supercript au diferit semnificativ). Numărul de pui de sex masculin pe probă a fost de 9 zile (10 pe grup), 15 zile (8-10 pe grup) și 21 zile (9 pe grup).

DISCUŢIE

PL, PLRP1 și PLRP2 sunt din aceeași familie genetică, după cum se demonstrează prin omologia genei și asemănarea structurală (8,35,36). Atât expresia genei PLRP1, cât și PLRP2 au un model de dezvoltare diferit de ARNm PL (9). Această reglementare an-ticoordonată a PLRP și PL sugerează că în timpul dezvoltării șobolanilor, genele PLRP sunt sub controale de reglementare diferite decât gena PL. Nivelurile relativ ridicate

Modificarea conținutului de grăsime din matern a modificat conținutul de acizi grași din lapte la barajele care consumau niveluri scăzute, moderate și ridicate de ulei de șofrănel. Cantitatea de PUFA (în principal 18: 2) în lapte a fost crescută odată cu creșterea grăsimilor polinesaturate din dieta maternă. Acest fenomen este în acord cu studiile anterioare (23-25).

Nivelurile de ARNm PLRP1 au fost semnificativ afectate de dezvoltare în acord cu rapoartele anterioare ale Payne și colab. (9). Nivelurile de ARNm PLRP1 au fost ridicate în perioada postnatală timpurie (d9 și d15) și au scăzut brusc după înțărcare (d21) la niveluri scăzute la vârsta adultă. Cantitatea diferită de grăsimi polinesaturate din lapte și dietă nu a afectat expresia PLRP1. Lipsa de influență a cantității de grăsimi din dietă asupra exprimării PLRP1 la șobolanii înțărcați în această lucrare este surprinzătoare și diferă de alte studii (16,20,22,37), în care s-a dovedit că PLRP1 este reglementat transcripțional de grăsimea din dietă. Cu toate acestea, introducerea diferitelor cantități de PUFA, începută mai devreme în faza terțiară a dezvoltării pancreatice, poate modifica reglarea pe termen lung a PLRP1. O astfel de „imprimare metabolică” a fost propusă pentru alte lipide alimentare, cum ar fi colesterolul, dar rămâne extrem de controversată.

Expresia de dezvoltare a ARNm PLRP2 a fost ridicată în perioada postnatală timpurie și a scăzut brusc până la faza de înțărcare (21 d postnatal) la niveluri nedetectabile la vârsta adultă (d56). Acest lucru este de acord cu modelul de dezvoltare raportat inițial de Payne și colab. (9). Încă din 15 zile în timpul fazei de alăptare, a existat un efect semnificativ al dietei (LF = MF> HF; P