Departamentul de Științe Biologice de Afiliere, Universitatea Simon Fraser, Burnaby, Columbia Britanică, Canada

spatele

Departamentul de Științe Biologice de Afiliere, Universitatea Simon Fraser, Burnaby, Columbia Britanică, Canada

Cifre

Abstract

Citare: Shikano I, Cory JS (2014) Mecanismul dietetic din spatele costurilor asociate cu rezistența la Bacillus thuringiensis în colierul de varză, Trichoplusia ni. PLOS ONE 9 (8): e105864. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0105864

Editor: Guy Smagghe, Universitatea din Gent, Belgia

Primit: 11 decembrie 2013; Admis: 28 iulie 2014; Publicat: 29 august 2014

Finanțarea: Sprijinul financiar a fost oferit de către Grantul pentru descoperire în științele naturii și ingineria din Canada (NSERC) pentru descoperirea J.S.C. și o bursă doctorală NSERC Alexander Graham Bell Canada, o bursă de admitere absolventă a secolului Pacific de la guvernul BC și o bursă specială de admitere specială țintă de la SFU la I.S. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Utilizarea repetată a insecticidelor chimice, precum și a mai multor insecticide microbiene, a dus la evoluția rezistenței la numeroase specii de insecte [1] - [5]. Cu toate acestea, mutațiile care conferă rezistență reduc adesea condiția fizică în absența insecticidului [6] - [10]. Prin urmare, evoluția și stabilitatea rezistenței la insecticide microbiene și chimice este considerată a fi puternic influențată de costurile de fitness [11], .

Bacteria producătoare de toxine Bacillus thuringiensis (Bt) este insecticidul microbian cu cel mai mare succes comercial, iar plantele de cultură modificate genetic pentru a exprima toxinele Bt au fost plantate în 66 de milioane de hectare în întreaga lume [13]. Expunerea repetată la Bt a pus o presiune puternică de selecție asupra erbivorelor țintă, rezultând în unele cazuri evoluția rezistenței [3], [5], [14]. Rezistența la majoritatea speciilor scade rapid în absența expunerii la Bt, sugerând un compromis în care alelele pentru rezistența la Bt cresc condiția fizică în prezența Bt, dar provoacă costuri de fitness în absența acesteia [15]. Costurile de fitness asociate cu rezistența la spray-urile Bt sau toxinele Bt au fost găsite la reprezentanții dintr-o familie de Coleoptera (Chrysomelidae [16]) și Diptera (Culicidae [17]) și patru familii de Lepidoptera (Noctuidae [18], [19], Plutellidae [20], [21], Pyralidae [22] și Gelechiidae [23]).

Costurile de fitness asociate cu rezistența la Bt sunt puternic influențate de variația ecologică, cum ar fi plantele pe care insectele se hrănesc [21], [33] - [38], și sunt mărite de fitochimicale defensive care reduc performanța hrănirii prin efecte toxice directe sau prin reducerea disponibilitatea nutrienților [15]. În tulpina noastră de T. ni rezistentă la Bt, gradul costurilor de fitness asociate rezistenței (greutate mai mică a pupei și o rată de dezvoltare mai lentă) a crescut odată cu scăderea adecvării plantelor gazdă [33], [39]. Am emis ipoteza că aceste costuri ar putea fi cauzate de o capacitate afectată de a transforma substanțele nutritive ingerate în creșterea corpului. De asemenea, am arătat recent că tulpina rezistentă la Bt selectează un raport mai mare de proteine ​​la carbohidrați decât tulpina susceptibilă atunci când li se permite să compună propria proteină în dieta carbohidraților [40]. Aportul mai multor proteine ​​ar putea indica hrănirea compensatorie pentru a depăși conversia afectată a proteinei ingerate în azot corporal sau necesitățile crescute de proteine ​​pentru a menține un răspuns imun crescut [41], [42].

Materiale și metode

Studiați animalele

Colonia T. ni rezistentă la Bt a fost menținută la 25 ° C și fotoperiodă 16∶8 (L∶D) pe o dietă standard pe bază de germeni de grâu, de la colecția sa originală dintr-o seră comercială de tomate din Columbia Britanică, Canada în 2001 (etichetat T2c în [19]). Rezistența la Bt a fost menținută prin expunerea larvelor la 40 KIU ml -1 dietă Bt subsp. kurstaki (DiPel 2x DF, Valent Biosciences, Libertyville, IL, SUA) în fiecare generație. Colonia susceptibilă la Bt derivă din linia rezistentă la Bt, dar a fost crescută fără expunere la Btk [19]. Aproximativ 200 de molii au fost împerecheate în fiecare generație pentru a minimiza consangvinizarea. Încrucișările dintre coloniile rezistente și susceptibile au fost efectuate pentru a omogeniza fondul genetic al acestora, apoi au fost selectate din nou cu Bt, astfel încât diferența genetică majoră dintre cele două colonii ar fi probabil rezistența la Bt [49]. În scopul acestui studiu, am folosit larve din linia susceptibilă la Bt (Bt-S) și larve din linia rezistentă la Bt care nu au fost selectate cu Bt pentru o generație (Bt-RU) înainte de experimentele pentru a reduce efecte transgeneraționale din selecțiile Bt [33].

Dietele artificiale

Experiment de hrănire

Conținutul de lipide și azot al pupelor a fost măsurat pentru a determina diferențele în utilizarea nutrienților asociate cu rezistența la Bt. Pentru a măsura conținutul de lipide pupale, pupele uscate au fost extrase cu lipide în trei modificări de cloroform la fiecare 24 de ore, apoi re-uscate și re-cântărite. Doar subseturile de pupe lipidice au fost analizate pentru conținutul de azot din cauza constrângerilor logistice. O submostă selectată aleatoriu din zece pupe uscate lipidice din fiecare tratament dietetic per colonie a fost măcinată individual timp de 10 secunde într-o pulbere omogenă folosind un Mini-BeadBeater (BioSpec Products, Bartlesville, OK, SUA). O probă de pulbere de aproximativ 2 mg din fiecare pupă a fost cântărită la 0,001 mg și încărcată pe un analizor elementar (Vario Micro Cube CHNS Analyzer, Elementar Americas Inc.). Conținutul de azot al fiecărei probe determinat de analizorul elementar a fost utilizat pentru a calcula înapoi și a estima conținutul de azot în fiecare pupă.

Experiment Bt-provocare

Larvele din al patrulea stadiu proaspăt năpârlite au fost hrănite în mod individual cu unul din cele cinci tratamente dietetice în celule ale plăcilor de cultură tisulară cu 48 de godeuri până la năpârlirea până la al cincilea stadiu. Cel de-al cincilea instar proaspăt năpârlit a fost transferat în celule individuale ale plăcilor de cultură tisulară cu 12 godeuri care conțin dietă de colonie tratate cu una dintre cele cinci concentrații de Bt (DiPel) (0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 KIU ml -1 dieta pentru Bt- S; dieta 0, 10, 20, 40, 80, 160 KIU ml -1 pentru Bt-RU). Larvele au fost provocate cu Bt pe dieta coloniei pentru a egaliza expunerea la Bt între tratamentele dietetice. Au existat 48 de larve pe concentrație de Bt pe dietă de tratament pe colonie. Mortalitatea larvară a fost înregistrată după trei zile în dieta tratată cu Bt.

Analize statistice

Rezultate

Performanţă

Indivizii Bt-RU au avut o masă pupală semnificativ mai mică decât insectele Bt-S; cu toate acestea, acest lucru a variat cu raportul P∶C dietetic, linia Bt-RU fiind mai puțin afectată de raportul nutrienților (Figura 1A; Tabelul 1). Pupele Bt-S au cântărit mai mult decât Bt-RU pe cele trei raporturi P dietC dietetice cele mai echilibrate, dar masa pupelor Bt-S a scăzut pe cele două diete cu un raport P∶C extrem, rezultând mase similare pentru ambele linii. Rata relativă de creștere (RGR) a Bt-S a fost, de asemenea, semnificativ mai rapidă decât Bt-RU, dar aceasta a variat, de asemenea, în funcție de dietă și a atins semnificația doar pentru dieta echilibrată (30p∶30c) (Figura 1B; Tabelul 1). Pentru Bt-RU, RGR a fost semnificativ mai scăzut în dieta cea mai bogată în carbohidrați față de alte diete. Pentru Bt-S, RGR a fost semnificativ mai scăzut la ambele diete extreme, comparativ cu cele trei cele mai echilibrate diete. Cele două tulpini T. ni au luat același timp pentru a ajunge la stadiul pupal (Figura 1C; Tabelul 1), iar timpul până la pupație a fost întârziat doar în dieta cea mai bogată în carbohidrați pentru ambele tulpini.

(A) Greutatea uscată pupală și (B) rata relativă de creștere (RGR) pentru larvele finale Bt-S și Bt-RU din ultimele cinci diete ale raportului P∶C, prezentate ca mijloace cu cel mai mic pătrat (± SE) ajustate pentru greutatea larvelor inițiale și sexul. (C) Numărul mediu (± SE) de zile până la pupație. RGR = [ln (masa pupală uscată) - ln (masa larvară inițială uscată)]/zile până la pupație [53]. Diferite litere indică diferențe semnificative (comparația Tukey HSD).

Aportul de nutrienți și eficiența conversiei în masă corporală

Bt-RU a consumat semnificativ mai puțin decât Bt-S (Colonia, F1,182 = 33,84 p. Figura 2. Costurile de fitness în T. ni sunt asociate cu consum redus.

Consumul de diete (proteine ​​și carbohidrați combinați) prin larvele Bt-S și Bt-RU din ultimul stadiu în cele cinci diete ale raportului P∶C pe stadionul larval complet. Consumul este prezentat ca mijlocul celor mai mici pătrate (± SE) ajustat pentru greutatea larvară inițială și sex. Diferite litere indică diferențe semnificative (comparația Tukey HSD).

Insectele vor selecta cantități specifice de substanțe nutritive necesare pentru a obține un amestec optim de substanțe nutritive atunci când li se oferă o gamă de alimente care diferă în ceea ce privește conținutul nutrițional. Aceasta a fost denumită ținta de aport (a se vedea revizuirea de către [48]). Aici, larvelor T. ni au fost împiedicate să-și atingă ținta de aport (obținută din [40]) deoarece erau limitate la unul dintre cele cinci rapoarte P∶C. Când am examinat cantitatea de proteine ​​și carbohidrați pe care le-au consumat pe fiecare raport P∶C și l-am comparat cu cantitatea optimă pe care o cereau (țintă de aport), am constatat că pentru ambele tulpini T. ni, consumul de carbohidrați s-a deviat mai mult de la aport țintă decât consumul de proteine ​​(Figura 3). Acest lucru sugerează că menținerea aportului de proteine ​​aproape de ținta lor de aport este mai importantă decât menținerea aportului de carbohidrați.

Cele mai mici pătrate bivariate înseamnă (± SE) pentru aportul de proteine ​​și carbohidrați pentru larvele Bt-S și Bt-RU din ultimul moment ajustate pentru greutatea larvară inițială și sex. Punctele de-a lungul fiecărei traiectorii corespund aportului cumulativ de proteine ​​și carbohidrați pe întreg stadionul larval final. Liniile cenușii solide reprezintă raporturi nutritive pentru cele cinci tratamente alimentare (P∶C = 50∶10, 40∶20, 30∶30, 20∶40, 10∶50). Punctele de admisie pentru fiecare zi sunt conectate prin linii negre solide și linii negre punctate pentru Bt-S și respectiv Bt-RU. Țintele optime de admisie (Bt-S, cerc gri; Bt-RU, triunghi gri) au fost obținute de la Shikano și Cory [40].

Conținutul de lipide și azot al pupelor rezultate a fost reprezentat grafic în funcție de cantitatea de carbohidrați și proteine ​​ingerate pentru a evalua efectul aportului de macronutrienți asupra compoziției corpului (Figura 4). Conținutul de lipide pupale a crescut și a ajuns treptat la un platou pe măsură ce raportul P∶C al dietei sa mutat de la bogat în proteine ​​la bogat în carbohidrați (raportul P∶C, F4,182 = 141,34, p Figura 4. Lipidele corporale și azotul acumulate în tratamente dietetice.

(A) Conținutul de lipide pupale reprezentat de aportul de carbohidrați și (B) conținutul de azot pupal reprezentat de aportul de proteine ​​în cele cinci diete ale raportului P∶C pentru larvele de ultimă instanță Bt-S și Bt-RU. Datele sunt prezentate ca mijloace cu cel mai mic pătrat (± SE) ajustate pentru greutatea larvară inițială și sex.

Pentru a compara eficiența conversiei carbohidraților în lipide între colonii, am adăugat cantitatea de carbohidrați consumată de fiecare larvă individuală sub formă de covariabil. Aceasta ajustează carbohidrații consumați, astfel încât să putem compara cantitatea de lipide care a fost produsă dacă toate larvele ar consuma aceeași cantitate de carbohidrați. Eficiența conversiei carbohidraților în lipide a scăzut pe măsură ce raportul P∶C al dietei a devenit bogat în carbohidrați (Figura 5A, Tabelul 2). Mai mult, Bt-RU a transformat carbohidrații mai eficient în lipide decât Bt-S în cele două diete bogate în carbohidrați.

(A) Eficiența conversiei carbohidraților ingerați în conținut de lipide pupale și (B) proteine ​​ingerate în conținut de azot pupal din Bt-S pupate (bare solide) și Bt-RU (bare deschise) în cele cinci tratamente dietetice P∶C. Eficiența conversiei macronutrienților ingerați în conținutul corpului este prezentată ca mijloace cu cel mai mic pătrat de conținut corporal ajustat pentru cantitatea de macronutrienți ingerați (carbohidrați sau proteine), greutatea larvelor inițiale și sexul. Diferite litere indică diferențe semnificative (comparația Tukey HSD).

Conținutul de azot pupal a fost consistent în raporturile P∶C, cu excepția celei mai slabe diete proteice (raportul P∶C al dietei, F4.88 = 51.66, p 2 = 165.77, p 2 = 10.80, p = 0.03; Tabelul 3; Figura S1). Așa cum era de așteptat, mortalitatea a crescut odată cu creșterea concentrației de Bt (X1 2 = 522,15, p 2 = 62,34, p 2 = 12,11, p 2 = 337,15, p 2 = 2,04, p = 0,73), indicând faptul că, în timp ce nivelurile de mortalitate diferă între P∶ Dietele cu raport C, rata la care a crescut mortalitatea cu concentrația de Bt a fost aceeași pe fiecare dietă (adică pante egale). Nu a existat un control al mortalității atât pentru Bt-S, cât și pentru Bt-RU.

Discuţie

Rezistența la BT la mai multe specii este asociată cu costuri semnificative, cum ar fi greutatea pupală redusă și rata de creștere mai lentă. Descoperirile noastre arată că, în tulpina noastră de T. ni, aceste costuri sunt suportate în primul rând de consumul redus de alimente și de conversia neafectată a substanțelor nutritive ingerate în masa corporală. De fapt, în anumite condiții alimentare, larvele rezistente la Bt au transformat nutrienții mai eficient decât larvele sensibile. Cu toate acestea, o eficiență mai mare a transformării proteinelor în azot corporal în dieta cea mai bogată în proteine ​​a fost asociată cu o creștere semnificativă a mortalității în comparație cu dietele mai echilibrate atunci când a fost provocată cu Bt. Acest lucru demonstrează un efect negativ al consumului de proteine ​​alimentare în exces la insectele rezistente la Bt.

Conținutul de lipide corporale a crescut constant în ambele tulpini, pe măsură ce a crescut cantitatea de carbohidrați ingerată. Cu toate acestea, eficiența cu care carbohidrații au fost transformați în lipide a scăzut odată cu creșterea conținutului de carbohidrați din dietă. Acest lucru indică faptul că larvele T. ni reglează conținutul de lipide din corp, posibil printr-un mecanism de reglare post-ingerativ care eliberează carbohidrați supraalimentați din corpul lor [52]. În mod interesant, Bt-RU a avut o eficiență mai bună de conversie a carbohidraților în lipide în dietele bogate în carbohidrați. Acumularea mai multor lipide corporale poate fi avantajoasă, deoarece poate prelungi supraviețuirea în timpul foametei [59]. Rezistența Bt în Bt-RU nu este un răspuns total sau nimic. Concentrațiile mari de Bt încă inhibă hrănirea și creșterea lentă datorită efectelor dăunătoare ale toxinelor Bt asupra intestinului insectelor. Prin urmare, supraviețuirea foametei ar putea fi o componentă importantă a rezistenței Bt în această tulpină.

Cu toate acestea, această noțiune este contrazisă de supraviețuirea mai mare a ambelor tulpini după provocarea cu Bt atunci când se alimentează în prealabil cu diete cu proteine ​​mai mari (cu excepția 50p∶10c pentru Bt-RU). Formularea Bt utilizată în acest studiu conține spori Bt în plus față de toxine. Odată ce toxinele încalcă intestinul mediu, sporii Bt acționează sinergic cu toxinele germinând în hemolimfa insectelor provocând septicemie [31], [32]. Studiile asupra larvelor de lepidopteran au constatat modificarea activității imune în urma inoculărilor orale cu formulări de spori Bt și toxine, cum ar fi creșterea activității fagocitice și a ratei de încapsulare [60], precum și modificări ale densității hemocitelor și ale activității fenoloxidazei [61]. Mai mult, inducerea unui răspuns imun (rata reacției de melanizare) cu o concentrație scăzută a unei formulări Bt a fost asociată cu o creștere ulterioară a supraviețuirii pentru a provoca cu aceeași formulare Bt [29]. Deoarece densități mai mari de hemocite [42], precum și activități mai mari antimicrobiene, de încapsulare și fenoloxidază [41] au fost găsite în hemolimfa larvară a două specii de Spodoptera după consumarea unor diete cu un raport P∶C mai mare, este posibil ca T. ni care au hrănit pe dietele cu proteine ​​mai ridicate au avut o activitate imunitară de bază mai mare în momentul provocării Bt.

Am observat o scădere cu 44% a LC50 în Bt-RU pe cea mai ridicată dietă proteică, comparativ cu un vârf pe dieta 40p∶20c, în timp ce LC50 a larvelor Bt-S a continuat să crească odată cu nivelurile de proteine, rezultând o scădere dramatică a raportul de rezistență (Tabelul 3). Cu toate acestea, Bt-S a avut o greutate pupală semnificativ mai scăzută și o rată de creștere în cea mai protejată dietă. Astfel, excesul de proteine ​​alimentare este dăunător pentru fiecare linie T. ni, dar în moduri diferite. Acest lucru s-ar putea datora costurilor mai mari ale catabolizării excesului de proteine ​​ingerate [55], [62]. Efectele negative ale excesului de proteine ​​dietetice asupra performanței au fost observate la alte specii de lepidopter [63], [64], dar acesta este primul studiu care arată o creștere a sensibilității unei insecte rezistente la un insecticid microbian.

În cele din urmă, costurile de fitness asociate cu rezistența la Bt în tulpina noastră T. ni s-au datorat consumului redus de alimente, mai degrabă decât procesării mai puțin eficiente a nutrienților. Consumul redus ar putea rezulta dintr-o schimbare a mecanismului de feedback care implică chemorecepția de contact periferică. Oferă informații despre conținutul de nutrienți ai alimentelor și compoziția chimică a hemolimfei, care reflectă calitatea și cantitatea de absorbție a nutrienților și activitățile metabolice ale insectei [58]. T. ni rezistente la Bt au densități mai mici de hemocite și concentrații mai mici de proteine ​​și fenoloxidază în hemolimfă decât T. ni susceptibile [61]. Cerințe mai mici pentru aceste componente hemolimfice ar putea influența mecanismul de feedback, reducând astfel aportul de nutrienți. Cu toate acestea, este important să rețineți că aportul de nutrienți este un proces dinamic care va fi influențat de factorii de stres ai mediului. De exemplu, s-a demonstrat recent că T. ni-ul nostru rezistent la Bt crește consumul de alimente și creșterea în greutate atunci când este hrănit cu o dietă artificială tratată cu doze mici de Bt comparativ cu un control [65].

O limitare importantă a prezentului studiu este utilizarea cazeinei ca singură sursă de proteine ​​(de la un animal) și a zaharozei ca singură sursă de carbohidrați, deoarece acestea nu sunt reprezentative pentru varietatea de substanțe nutritive disponibile pentru T. ni care se hrănește cu plante. Prin urmare, întrebarea critică care rămâne se referă la măsura în care rapoartele macronutrienților afectează performanța T. rezistente și sensibile la Bt nu se află pe plantele gazdă naturale, deoarece majoritatea omizilor erbivore au acces la o varietate de plante și părți ale plantelor care variază în ceea ce privește conținut. [66]. Sunt necesare mai multe studii privind costurile de fitness care încorporează ecologia nutrițională utilizând alte tulpini rezistente la Bt pentru a determina generalitatea constatărilor noastre.

informatii justificative

Figura S1.

Logit mortalitatea de Bt-provocat T. ni tratamente dietetice hrănite în prealabil. Variația mortalității Bt-RU și Bt-S la Bt după pre-hrănire cu una dintre cele cinci diete cu raport P∶C. Simbolurile arată punctele de date reale (simboluri solide, Bt-S; simboluri deschise, Bt-RU) și linii (linie continuă, Bt-S; linie punctată, Bt-RU) sunt modelele montate. Analizele statistice au fost efectuate separat pentru Bt-S și Bt-RU. Valorile de 0% sau 100% nu sunt reprezentate în logite.

Set de date S1.

Date privind aportul de nutrienți și măsurile de dezvoltare.