Sensibilitatea moleculară a spectroscopiei Raman o face promițătoare pentru aplicațiile clinice: poate identifica agenții patogeni mult mai rapid decât metodele actuale, poate investiga celulele tumorale circulante, poate ajuta chirurgii să distingă tumorile de țesutul sănătos și să identifice natura chimică a plăcilor cardiovasculare și să le evalueze severitatea.

spectroscopiei

Populația în vârstă de astăzi prezintă o mare provocare: asigurarea unor sisteme de îngrijire a sănătății accesibile și durabile. Pe măsură ce numărul persoanelor peste 65 de ani crește, societatea se confruntă cu o creștere a bolilor legate de vârstă. În consecință, numărul cazurilor de degenerescență maculară în Germania, de exemplu, se va dubla în următorii 15 ani. Creșteri similare au fost proiectate pentru numărul de atacuri de cord și noi cazuri de demență, în timp ce numărul cazurilor de cancer descoperite recent se estimează că va crește cu „doar” 50 la sută. 1 În plus, noi probleme, cum ar fi riscul crescut de pandemie, vor căuta soluții. În același timp, utilizarea adesea neglijentă a antibioticelor duce treptat la apariția agenților patogeni rezistenți. 2

Pentru a face față tuturor acestor provocări va fi nevoie de noi metode și dispozitive cu care - în mod ideal - bolile să poată fi prinse și combătute înainte ca acestea să fie chiar răspândite.

Metodele fotonice pot fi cheia. Fotonica va permite o înțelegere a dezvoltării bolii la nivel molecular și astfel va facilita în cele din urmă un medicament personalizat. O metodă fotonică deosebit de promițătoare și versatilă este spectroscopia Raman și variantele sale. Ca și în cazul tuturor metodelor bazate pe lumină, spectroscopia Raman permite măsurarea necontact, dar spre deosebire de spectroscopia fluorescentă, de exemplu, nu necesită etichete exogene. Aceasta înseamnă că tehnica are potențialul de a accelera semnificativ sau chiar de a înlocui analiza de laborator și de a permite diagnosticarea aproape de pacient, deoarece este relativ rapidă și, de asemenea, foarte precisă. Mai ales în domeniul imagisticii, trebuie subliniată specificitatea ridicată și invazivitatea redusă. Alte avantaje ale spectroscopiei Raman includ rezoluția spațială ridicată, lipsa necesității pregătirii probelor care consumă mult timp și capacitatea de a lucra într-un mediu apos.

Diagnosticul agentului patogen

În mod clasic, diagnosticul de agenți patogeni se bazează pe inițierea, creșterea și analiza unei culturi de agenți patogeni, un proces care poate dura până la o săptămână și necesită personal experimentat. Dar, în cazul șocului sepsisului, de exemplu, rata de supraviețuire scade dramatic cu fiecare oră care trece înainte de tratamentul vizat - scăzând la o rată de mai puțin de 20% după doar 12 ore. În cazul ideal, o infecție ar fi asociată cu un agent patogen în câteva ore.

Deoarece fiecare specie bacteriană are o semnătură Raman unică, spectroscopia Raman este potrivită pentru identificarea acesteia. În plus, cu microscopia Raman, un spectru al unei singure bacterii este în general suficient pentru identificare.3 Cu toate acestea, distincțiile dintre spectrele diferitelor specii sunt adesea subtile, iar diferențierea prin inspecție vizuală nu este, în general, posibilă. Spectrul bacterian este în final suma semnăturilor spectrale ale tuturor substanțelor conținute, cum ar fi apa, proteinele, grăsimile, acizii nucleici și carbohidrații (Figura 1a). Chiar și bacteriile din aceeași specie prezintă variații subtile cauzate de diferențe în starea de creștere, condiții diferite între pacienți, cum ar fi starea nutrițională și setările de tratament și localizarea variabilă la pacienți (centrele de infecție). Pentru agenții patogeni aflați în afara pacientului, factorii de mediu precum conținutul de oxigen și dioxid de carbon din aer, temperatura și lumina joacă un rol.

figura 1. (A) Spectre Raman ale principalelor componente biologice ale bacteriilor: apă, proteine, acizi nucleici (ADN), carbohidrați și grăsimi. În spectrele Raman ale diferitelor tulpini stafilococice care servesc ca exemple, pot fi recunoscute mai multe benzi ale componentelor individuale. (b) Bio Particle Explorer de la rapID. Imagini oferite de autorii autorilor.
Soluția este de a aplica tehnici chimiometrice spectrelor Raman ale bacteriilor. În acest caz, un spectru este împărțit în zone distincte care sunt comparate matematic cu arii echivalente din spectrele bacteriene care au fost colectate într-o bază de date extinsă. În medie, este posibil să se determine în mod corect aproape 99% din speciile bacteriene și chiar și tulpina poate fi determinată cu o precizie medie de peste 92%. 3 Pentru a determina contaminarea bacteriană în camere curate sau sisteme de aer condiționat, o soluție adecvată este deja disponibilă comercial (Bio Particle Explorer din rapID, Figura 1b). Acest sistem folosește spectroscopia de fluorescență pentru a distinge între particule neînsuflețite și bacterii; bacteriile sunt apoi identificate prin intermediul spectroscopiei Raman.

Potențialul său de utilizare clinică necesită capacitatea sa de a identifica bacteriile în medii complexe, cum ar fi saliva, urina sau chiar sângele. În general, bacteriile trebuie separate de aceste medii; în caz contrar, mediul împiedică identificarea sau chiar o face imposibilă. Pentru această etapă de separare, în prezent sunt dezvoltate cipuri microfluidice care utilizează, de exemplu, dielectroforeza pentru a prinde bacteriile și a le face accesibile măsurării. 4 Această metodă poate fi utilizată și pentru măsurarea bacteriilor direct în soluție și astfel permite - pe lângă identificare - afirmații despre susceptibilitatea sau rezistența la antibiotice.

Diagnosticul oncologic

Din țesutul cancerigen, celulele tumorale se pot desprinde, pot intra în sânge și, în cele din urmă, pot provoca metastaze. Aceste celule tumorale izolate sunt relativ accesibile și au o valoare diagnostic mare. Pe de o parte, detectarea lor ajută la verificarea prezenței unei tumori și la localizarea și identificarea acesteia. Pe de altă parte, stadiul tumorii primare poate fi determinat pe baza celulelor tumorale circulante, iar succesul chimioterapiei poate fi evaluat.

Principiul detectării corespunde substanțial cu cel al citometriei optice în flux: sângele este trecut printr-un cip microfluidic; celulele individuale sunt apoi capturate prin capcane optice, examinate utilizând spectroscopia Raman și clasificate și sortate pentru utilizare ulterioară.

Comparativ cu citometria cu flux optic, metoda Raman permite un diagnostic mult mai precis al celulei individuale. Dezavantajul este un randament mult mai mic (cinci până la șase celule pe minut), dar acest lucru poate fi îmbunătățit semnificativ în viitor, cu actualizări legate de dispozitive și componente.

Figura 2 prezintă un cip microfluidic realizat din cuarț pentru sortarea celulelor activate de Raman. 5 Spectrele Raman neprelucrate sunt influențate de proprietățile spectrale ale filtrelor, ale laserelor de captare și ale materialului substrat. Prin urmare, clasificarea cu succes necesită suprimarea acestor proprietăți, astfel încât amprenta spectrală a celulelor albe din sânge (verzi) și a celulelor tumorale (portocaliu, maro, albastru) să fie făcută vizibilă.

Avantajul CARS față de Raman constă într-un timp de înregistrare a imaginii mult mai scurt (până la un factor de 104) datorită unei creșteri puternice a secțiunii transversale de împrăștiere. Spre deosebire de Raman și CARS, SHG și TPEF subliniază detaliile morfologice: SHG este deosebit de sensibil pentru structurile noncentrosimetrice ordonate, cum ar fi colagenul, în timp ce TPEF răspunde la substanțe fluorescente endogene, cum ar fi NAD (P) H, flavine și elastină.

Figura 3 compară imaginile microscopice TPEF, CARS și Raman ale unei secțiuni subțiri necolorate a tumorii cerebrale cu o imagine microscopică a aceleiași probe după colorare cu hematoxilină și eozină. În special nucleele celulare, care sunt rezolvate cu toate metodele, sunt de interes pentru o evaluare histopatologică. Cu ajutorul informațiilor morfologice și funcționale combinate prin abordarea multimodală, sunt șanse mari să se dezvolte instrumente fotonice care nu numai că pot detecta și clasifica tumorile precoce, dar permit, de asemenea, localizarea limitelor tumorale în timpul intervenției chirurgicale.

O aplicație potențială in vivo a spectroscopiei Raman este examinarea endoscopică a plăcilor arteriale. Metodele convenționale, cum ar fi ultrasunetele intravasculare sau tomografia cu coerență optică, oferă în general doar informații morfologice. Pentru a evalua dacă un depozit în interiorul unei artere este periculos - adică se poate desprinde de peretele vasului și poate provoca blocaje și, prin urmare, atacuri de cord sau accidente vasculare cerebrale - este esențială o evaluare a compoziției plăcii.

Spectrele Raman ale componentelor potențiale ale plăcilor - fosfat de calciu, țesut conjunctiv, trigliceride și colesterol - sunt bine distinse, astfel încât spectroscopia Raman endoscopică poate determina în esență compoziția plăcii și, astfel, pericolul depunerilor.

Primele experimente pe iepuri au confirmat valoarea acestei abordări. Așa cum se arată în Figura 4, a fost folosită o sondă cu diametrul de 1 mm cu o fibră de excitație centrală și 12 fibre de detecție pentru măsurători ex vivo7 pentru a înregistra spectrele Raman în condiții in vivo. Semnalele depunerilor de plăci diferă prin intensitatea și contribuțiile spectrale ale lipidelor de la semnalele peretelui arterial cu benzi de colagen și de la sânge cu benzi de celule roșii din sânge. Dezvoltările viitoare urmăresc să combine Raman cu tomografie cu coerență optică și/sau cu ultrasunete pentru a fuziona morfologic cu informații specifice moleculei. În plus, miniaturizarea este planificată pentru examinarea arterelor cu diametru mai mic.

Dr. Thomas Mayerhöfer este cercetător principal la Institutul de tehnologii fotonice Leibniz din Jena, Germania; e-mail: thomas.mayer [email protected]. Dr. Christoph Krafft este șeful grupului de lucru Spectroscopie/Imagistică la Institutul de tehnologii fotonice Leibniz; e-mail: [email protected]. Dr. Ute Neugebauer este lider de grup de cercetare junior la Institutul Leibniz de Tehnologii Fotonice și la Centrul pentru Controlul și Îngrijirea Sepsisului de la Spitalul Universitar Jena; e-mail: [email protected]. Dr. Jürgen Popp este director științific al Institutului de tehnologii fotonice Leibniz, membru al Centrului pentru Controlul și Îngrijirea Sepsisului din Spitalul Universitar Jena și directorul Institutului de Chimie Fizică de la Universitatea Friedrich Schiller din Jena; e-mail: [email protected].

Confirmare

Autorii mulțumesc Ministerului Turingian al Educației, Științei și Culturii (Project-B714-07037), Ministerului Federal al Educației și Cercetării (FKZ: 01EO1002/FKZ: 13N10774) și Uniunii Europene pentru sprijin financiar.

Referințe

1. F. Beske și colab. (2009). Prognoza morbidității 2050: Accidente selectate pentru Germania, Brandenburg și Schleswig-Holstein. Kiel: Institutul de Cercetare a Sistemelor de Sănătate.

2. Centrul European pentru Prevenirea și Controlul Bolilor (martie 2013). Raport anual epidemiologic 2012. Raportarea datelor de supraveghere din 2010 și a datelor de informații epidemice din 2011. Stockholm: ECDC.

3. M. Harz și colab. (Februarie 2009). Spectroscopie vibrațională - un instrument puternic pentru identificarea rapidă a celulelor microbiene la nivel unicelular. Citometrie A, Vol. 75A, pp. 104-113.

4. U.-Ch. Schröder și colab. (2013). Detectarea independentă de cultură a agenților patogeni ai sepsisului din bacteriurii: o combinație nouă de dielectroforeză și spectroscopie micro-Raman. Infecție, vol. 41 (Supliment. 1), P036.

5. S. Dochow și colab. (Martie 2013). Cip microfluidic de cuarț pentru identificarea celulelor tumorale prin spectroscopie Raman în combinație cu capcane optice. Anal Bioanal Chem, Vol. 405, pp. 2743-2746.

6. T. Meyer și colab. (10 februarie 2011). Microscopie neliniară, infraroșu și microspectroscopie Raman pentru analiza tumorilor cerebrale. J Biomed Opt, vol. 16, p. 021113.

7. C. Matthäus și colab. (Septembrie 2012). Caracterizarea in vivo a depozitelor de placă aterosclerotică prin spectroscopie Raman-sondă și imagistică microscopică anti-Stokes Raman coerentă in vitro pe un model de iepure. Anal Chem, Vol. 84, pp. 7845-7851.