Figurile și datele articolelor

Cifre

Pierderea Pdgfrβ ameliorează hiperplazia vitroasă primară. (A) Fotomicrografii reprezentative ale secțiunilor colorate cu H & E ale ochilor mouse-ului E13.5. Săgețile indică spațiul vitros posterior lentilei. G, GFP. (B) Cuantificarea celulelor vitroase totale la 625 μm 2 (*, P

factorului

Pierderea Arf îmbunătățește ARNm Pdgfrβ in vivo. (A și B) Secțiuni reprezentative colorate H & E ale ochilor mouse-ului E13.5 Arf +/+ și Arf Gfp/Gfp înainte (de sus) și după (de jos) captarea cu laser a microdisecției spațiului vitros (V), a obiectivului (L ) și retină (R). (C la E) amplificarea qRT-PCR a mARN-urilor indicate extrase din vitros (V), cristalin (L) și retină (R). **, șoareci P +/+. (F) Colorare reprezentativă a imunofluorescenței care arată că expresia Pdgfrβ în coroidă (vârfuri de săgeți) este neschimbată prin prezența sau absența Arf în embrionii E13.5. De asemenea, rețineți masa Pdgfrβ-pozitivă (săgeată) din spatele lentilei (L) în ochiul Arf Gfp/Gfp, care este absent în ochiul de tip sălbatic.

p19 Represiunea mediată de ARF a Pdgfrβ este dependentă de p53. (A) Western blot reprezentativ care arată că eliminarea mediată de shRNA a p53 (benzile 3 și 4) blunt inducția p53, dar nu reprimarea Pdgfrβ în ARF lacZ/lacZ MEF transduse cu un vector retrovirus care exprimă GFP sau p19 Arf. (B) Cuantificare digitală care arată cantitatea de proteină Pdgfrβ în Arf lacZ/lacZ MEF cu sau fără knockdown p53 și expresie ectopică Arf, așa cum este descris și prezentat în panoul A. Expresia Pdgfrβ a fost normalizată la cea a Hsc70 și exprimată relativ la cea din GFP -celule transduse care exprimă shRNA de control (Cntrl). *, P lacZ/lacZ MEF cultivate și manipulate așa cum este descris pentru panoul A. **, P

Pierderea p53 îmbunătățește ARNm Pdgfrβ, provocând hiperplazie vitroasă primară la ochiul șoarecelui. (A) Fotomicrografii reprezentative ale secțiunilor colorate cu H & E ale ochilor C57BL/6 p53 +/+ și p53 -/- de șoarece cu expansiune hiperplastică a celulelor în spațiul vitros (săgeți) la două animale reprezentative. (B) Secțiuni reprezentative colorate cu H & E care prezintă ochi de șoarece preluați din embrioni E13.5 ai genotipurilor indicate și fotografiate înainte (de sus) și după (jos) microdisecția vitrosului. Rețineți că hiperplazia vitroasă primară este deja evidentă în acest stadiu fără p53 (săgeată). (C) Cuantificarea mARN-urilor Arf (de sus) și Pdgfrβ (de jos) extrase din spațiul vitros al embrionilor E13.5 din genotipul indicat. Țesutul a fost obținut prin microdisecție de captare cu laser așa cum se arată în panoul B. Expresia a fost măsurată prin qRT-PCR și normalizată la cea a Hprt. *, Embrioni P +/+.

Expresia ARF blochează p53 și legarea ARN polimerazei II la promotorul Pdgfrβ. (A) Diagrama schematică care prezintă promotorul Pdgfrβ al șoarecelui și regiunile amplificate prin PCR. Numerele semnifică nucleotidele 5 ′ sau 3 ′ ale locului de început al transcrierii. (B și C) Cuantificarea produselor qPCR după imunoprecipitarea cromatinei cu anticorpi la p53 în MEF de tip sălbatic (B) și la ARN polimeraza II (PolII) în ARF lacZ/lacZ MEF (C) după transducție cu shRNA pentru a doborî p19 Arf (p19-1 și p19-2 reprezintă două constructe diferite de ARNm) (B) sau p53 (C). Cantitatea de produs ADN amplificat este exprimată ca procent din intrarea ADN, amplificată în paralel. *, P

p19 Arf reprimă sinteza proteinelor Pdgfrβ independent de p53. (A) Western blot reprezentativ care arată că expresia ectopică a p19 Arf reprimă Pdgfrβ în MEF lacZ/lacZ Arf, precum și MEF TKO, comparativ cu celulele transduse cu un retrovirus care codifică GFP singur. (B la D) Cuantificarea ARNm-urilor Pdgfrβ (B la D) și Vegf-A (D), măsurată prin qRT-PCR și normalizată la Hprt, în lizatele cu celule întregi din Arf lacZ/lacZ și TKO MEF (B), exprimate ca cantități relative în fracțiile citoplasmatice și nucleare din TKO MEF (C) și în fracțiunile polisomice din TKO MEF (D) transduse cu retrovirusuri care codifică Gfp și Arf, după cum sa indicat. Valorile reprezintă medii și abateri standard pentru experimentele triplicate și sunt normalizate la valorile pentru celulele transduse Gfp. **, P 35 S] Pdgfrβ marcat cu Cys/Met, care a fost imunoprecipitat din lizatele de celule întregi ale MEF TKO transduse cu retrovirus care exprimă Gfp sau Arf și marcate pentru timpul indicat chiar înainte de recoltare. Panoul din dreapta arată încorporarea 35 S în fracția de lizat de celule întregi folosită pentru imunoprecipitare.

Diagrama schematică care arată modelul potențial pentru modul în care efectele dependente de p53 și Arf asupra expresiei Pdgfrβ se pot intersecta. (A și C) În setarea de tip sălbatic (A), expresia Arf duce la reprimarea transcripțională dependentă de p53 a ARNm Pdgfrβ și represiunea posttranscripțională independentă de p53 a proteinei Pdgfrβ; în absența Arf (C), niciuna nu apare, iar acest lucru crește proteina Pdgfrβ, ducând la un fenotip asemănător PHPV. (B) Fără p53, se pierde reprimarea transcripțională a ARNm Pdgfrβ. În această setare, capacitatea relativă pentru reprimarea posttranscripțională dependentă de Arf poate determina dacă se dezvoltă un fenotip asemănător PHPV (panoul stâng versus panoul drept).