Javier Gil-Humanes

1 Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba, Spania,

Fernando Pistón

1 Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba, Spania,

Rossana Altamirano-Fortoul

2 Institutul de Agrochimie și Tehnologia Alimentelor, CSIC, Valencia, Spania,

Ana Real

3 Departamentul de Microbiologie și Parazitologie, Facultatea de Farmacie, Universitatea din Sevilla, Sevilla, Spania,

Isabel Comino

3 Departamentul de Microbiologie și Parazitologie, Facultatea de Farmacie, Universitatea din Sevilla, Sevilla, Spania,

Carolina Sousa

3 Departamentul de Microbiologie și Parazitologie, Facultatea de Farmacie, Universitatea din Sevilla, Sevilla, Spania,

Cristina M. Rosell

2 Institutul de Agrochimie și Tehnologia Alimentelor, CSIC, Valencia, Spania,

Francisco Barro

1 Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba, Spania,

Conceput și proiectat experimentele: JG-H CMR CS FB. Experimentele efectuate: JG-H FP RA-F AR IC. Analiza datelor: JG-H FP RA-F AR IC. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: CMR CS FB. A scris lucrarea: JG-H CMR CS FB.

Date asociate

Abstract

Introducere

Materiale și metode

Nu au fost necesare permise pentru studiul descris, care a respectat toate reglementările relevante.

Material vegetal

Patru linii transgenice de gliadină redusă ale Triticum aestivum cv. Bobwhite 208 (‘BW208’) și trei linii transgenice cu gliadină redusă de T. aestivum cv. Bobwhite 2003 („BW2003”) și liniile lor de tip sălbatic respective au fost testate utilizând un design aleatoriu de bloc complet cu două replici. Ambele tipuri sălbatice sunt soiuri de grâu de primăvară obținute de CIMMYT din crucea CM 33203 cu pedigree Aurora // Kalyan/Bluebird/3/Woodpecker. Cultivar BW2003 a fost selectat pentru eficiența sa mare de transformare și transportă translocația T1BL.1RS din secară. Pe de altă parte, BW208 derivă din linia SH 98 26 „Bobwhite” descrisă ca fiind extrem de transformabilă de Pellegrineschi și colab. [39] și nu conține translocarea secarei. În studiul de față, BW208 și BW2003 au arătat un conținut total de proteine ​​de ± 11,6% și respectiv .510,5% din greutatea uscată. Conținutul total de proteine ​​din gluten (gliadine plus glutenine) a fost de aproximativ 8,7% și 7,9% din greutatea uscată, respectiv pentru BW208 și BW2003.

Toate liniile transgenice de gliadină redusă au fost raportate anterior în [25] și conțineau fragmentul de repetare inversat (IR) ω/α (vectori pGhp-ω/α și/sau pDhp-ω/α) concepute pentru a regla în jos toate grupurile de gliadine de către RNAi. Liniile transgenice s-au autopolenizat timp de 4-5 generații și au prezentat fenotipuri normale în comparație cu tipurile lor sălbatice corespunzătoare.

Frezarea cerealelor

Făina albă a fost obținută din fiecare dintre cele două repetări independente ale liniilor cu gliadină redusă și de tip sălbatic. Boabele au fost hidratate la 16,5% umiditate prin adăugarea de apă distilată în două etape (24 h și 20 h înainte de măcinare) cu agitare continuă. Semințele hidratate (1 kg) din fiecare linie au fost măcinate separat în două etape într-o moară de test standardizată CD1 Chopin (Chopin Technologies, Villeneuve-la-Garenne Cedex, Franța). La primul pas s-au obținut făină albă și făină integrală. Făina integrală a fost reîncărcată într-o a doua etapă de măcinare, iar făina albă rezultată a fost amestecată cu cea obținută anterior, rezultând un randament total de aproximativ 60%. Făina a fost păstrată la temperatura camerei (RT) timp de o săptămână. Făină de orez comercială furnizată de Harinera Derivats del Blat de Moro, S.L. (Parets del Vallés, Spania) a fost folosit pentru a face pâinea de control fără gluten.

Coacerea pâinii

Aluatul a fost preparat pe bază de greutate făină: pentru 300 g făină, s-au adăugat 180 ml apă (225 ml apă pentru făina de orez), 3,6 g drojdie de brutar (Saf-Instant, Lesaffre, Franța) și 4,8 g sare de masă. Ingredientele au fost amestecate într-un Farinograf (Brabender GmbH & Co. KG, Germania) timp de 4 minute și odihnite timp de 10 minute cu o folie de plastic pentru a evita uscarea. Aluatul a fost împărțit manual (50 g), iar bucățile de aluat au fost rulate mecanic într-un omogenizator cu bile (Brabender GmbH & Co. KG, Germania). Bucățile de aluat au fost așezate pe tăvi de aluminiu și fermentate timp de 45 de minute la 30 ° C. Bucățile de aluat au fost coapte într-un cuptor electric cu convecție (Eurofours, Gommegnies, Franța). Procesul de coacere a fost efectuat la o temperatură fixă ​​a cuptorului de 180 ° C timp de 16 minute cu 2 injecții inițiale de abur de câte 10 sec. După coacere, pâinea a fost odihnită timp de 30 de minute la temperatura camerei pentru a se răci.

Caracterizarea pâinii

Greutatea și volumul pâinii au fost determinate în trei pâini din fiecare probă. Volumul pâinii a fost determinat prin metoda de deplasare a rapiței [40]. Conținutul de umiditate al pâinilor a fost determinat urmând metoda ICC nr. 110/1 [41], cu o etapă de pre-condiționare a probelor de pâine. Au fost scanate trei pâini din fiecare probă și feliile lor mediale (HP Scanjet 4400C, Hewlett-Packard, SUA), iar înălțimea și lățimea au fost determinate pentru a calcula ulterior raportul lățime/înălțime. Crusta și culoarea firimiturilor au fost determinate de un colorimetru Chroma Meter CR-400 (Konica Minolta Sensing Inc., Japonia) și exprimate într-o scară de culoare CIE-L * a * b * (CIE-Lab). Spațiul de culoare CIE-Lab este compus din trei axe perpendiculare: L *, a * și b *. Aceste trei coordonate indică luminozitatea culorii (L *; unde L = 100 indică culoarea albă și L = 0 culoare neagră) și poziția sa între verde și roșu (a *; unde valorile negative indică valorile verzi și pozitive Indicați roșu) și între albastru și galben (b *; unde valorile negative indică albastru și valorile pozitive indică galben). Au fost făcute două măsurători independente pentru fiecare dintre cele trei pâini pentru a determina culoarea crustei și a firimii.

Analiza senzorială descriptivă

A fost selectat un grup format din 11 evaluatori instruiți pentru a evalua probele de pâine (n = 20; 10 probe cu două repetări) corespunzătoare făinurilor de grâu cu gliadină redusă și sălbatică și făinii de orez. Gama de experiență a panourilor de testare a participării la analiza descriptivă și evaluarea la scară a unei game largi de produse de pâine a variat de la 3 la 20 de ani. Toate persoanele care alcătuiesc comisia și-au dat consimțământul în cunoștință de cauză. Panoul a evaluat aspectul, aroma, aroma și acceptarea generală a fiecărei probe într-o degustare oarbă. Pentru evaluare, un set de șase probe a fost prezentat în felii (1 cm grosime) pe vase de plastic codificate și servite într-o ordine aleatorie. În plus, evaluatorilor li s-a oferit apă minerală pentru a-și curăța palatul între degustări. Fiecare evaluator a primit o listă de atribute senzoriale și definițiile acestora pentru a-i îndruma în timpul evaluării eșantionului.

Caracterizarea profilului aminoacizilor

Făina integrală a fost utilizată pentru caracterizarea profilului de aminoacizi al liniilor cu gliadină redusă și de tip sălbatic. Probele de făină au fost hidrolizate folosind acid cloric 6 N și fenol, apoi derivatizate și analizate. Pentru derivatizare am folosit kitul de reactivi fluor fluorescenți AccQ (Waters). Mai întâi, 20 ofl din proba hidrolizată au fost amestecate cu 60 (l de soluție tampon (0,2 M borat tampon) și, ulterior, 20 µl de reactiv de derivatizare (2 mg/ml 6-aminoquinolil-N-hidrosisuccinimidil carbamat, AQC) s-au adăugat conform la instrucțiunile producătorului. După 10 minute la 50 ° C, soluția a fost injectată direct în sistemul de spectrometrie de masă tandem (HPLC-MS/MS) de înaltă performanță (VLC 320-MS). Separarea aminoacizilor a fost efectuată folosind 2,5 mM acetat de amoniu (pH = 5,75) ca solvent A și o soluție de 2,5 mM acetat de amoniu (pH = 6) și acetonitril (30 70, acetat de amoniu: acetronitril) ca solvent B. Coloana Pursuit XRs Ultra 2.8 C18 100 × 2,0 mm (Agilent) a fost utilizată ca fază staționară, iar debitul a fost de 200 pl/min. Detectarea a fost efectuată prin spectrometrie de masă (MS) cu modul de ionizare prin electrospray (ESI) (pozitiv și negativ). Cantitatea de aminoacizi este exprimată ca procent din greutatea totală a probei.

Microscopie electronică de scanare (SEM)

Probele (aluatul și pâinea) au fost înghețate și uscate și apoi fracturate manual, folosind vârful unei lame de ras și acoperite cu aur. Un microscop electronic cu scanare JEOL JSM6300 (JEOL, Tokyo, Japonia) a fost utilizat pentru a observa probele la 15 kV la RT. Imaginile SEM la măriri de 1000x și 3000x au fost luate pe suprafața nou expusă a fiecărei probe. S-au analizat eșantioane din liniile D894 (conținut redus de gliadină), E82 (conținut redus de gliadină și glutenină cu greutate moleculară mică (LMW)) și tipul sălbatic BW208.

G12 ELISA competitivă

Analize statistice

Datele au fost analizate cu software-ul statistic R versiunea 2.12.1 [42] folosind Graphical User Interface (GUI) R Commander. Ipotezele majore de analiză a varianței (ANOVA) au fost confirmate de testul Shapiro-Wilk pentru distribuția normală (funcția „shapiro.test”, statistici pachet), de testul Levene pentru homocedasticitate (funcția „leveneTest”, pachetul auto) și de modelul Ramsey test de eroare de specificație a ecuației de regresie (RESET) pentru liniaritate („resettest”; pachet lmtest), iar variabilele au fost transformate, dacă este necesar. Analiza statistică între diferitele linii a fost realizată utilizând modelul de analiză a varianței (ANOVA) „Variabilă ∼ Linie + Bloc” (funcția „aov”, pachetul agricolae), urmată de Diferența semnificativă (HSD) a lui Tukey post-hoc test de comparație (funcția „HSD.test”, pachetul agricolae). În toate analizele statistice, valorile P mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative.

Diferențele conținutului de aminoacizi între liniile de control și liniile cu conținut scăzut de gluten au fost evaluate utilizând modelul ANOVA „Variabil ∼ Bloc + Linie” cu funcția „lm” (statistici pachet). Comparațiile medii au fost efectuate prin testul de comparație multiplă post-hoc al lui Dunnett (funcția ‘glht’, pachetul multcomp). Graficul box-and-whisker a fost reprezentat grafic cu funcția ‘boxplot’ (pachet grafic).

Rezultate si discutii

Caracterizarea fizică a pâinii cu gliadină redusă

pâinea

(A) Pâini și felii de tip sălbatic BW208, linie cu gliadină redusă D793 și orez. (B) Proprietățile fizice ale pâinii obținute din linii de tip sălbatic, linii cu gliadină redusă și orez. Liniile cu aceeași literă indică faptul că nu există diferențe semnificative între ele, astfel cum a fost determinat de testul de comparație post-hoc Tukey HSD post-hoc, în perechi (P Figura 2A). Controlul orezului a prezentat scoruri semnificativ mai mici decât liniile de grâu cu gliadină redusă și linii de grâu de tip sălbatic pentru toți parametrii, indicând o calitate superioară a pâinilor de grâu. În plus, majoritatea liniilor cu gliadină redusă au prezentat niveluri de calitate comparabile statistic cu omologii lor de tip sălbatic. Deși acceptarea generală a fost redusă, cu un scor mediu de 7,4 pentru tipurile sălbatice și 6,6 pentru liniile cu gliadină redusă, nu s-au găsit diferențe semnificative între cele mai multe linii cu gliadină redusă și tipurile sălbatice. În schimb, acceptarea generală a orezului a fost semnificativ mai mică, prezentând un scor de 2,4. Acest lucru indică: i) nu există diferențe în ceea ce privește calitatea între aceste pâini cu gliadină redusă și pâinea normală cu făină de grâu și ii) potențialii consumatori ar prefera pâinea cu gliadină redusă în loc de pâinea de orez. În plus, un alt avantaj al pâinii cu gliadină redusă este că poate fi preparat folosind rețete simple și simple, spre deosebire de rețetele complexe utilizate în prezent pentru fabricarea produselor fără gluten din orez sau porumb, care sunt necesare pentru a da aceste produse au o calitate de coacere și organoleptică acceptabilă [48] - [50].

Microstructură de aluat și firimituri de pâine

SEM a fost efectuat la măriri de 1000x și 3000x în tipul sălbatic BW208 (A) și liniile cu gliadină redusă E82 (B) și D894 (C). Săgețile indică granulele de amidon acoperite de gluten în panoul (A) și granulele de amidon gol în panourile (B) și (C).

Aportul zilnic tolerabil de pâine cu gliadină redusă de către pacienții celiaci

tabelul 1

făină albăPâine
LiniaPpm total de gluten (medie ± SE)Epuizare (%)Ppm total de gluten (medie ± SE)Epuizare (%)Aport zilnic tolerabil (g) *
BW208 în greutate115042 ± 1000 26616 ± 387 1.9
D79313073 ± 82288.6748 ± 6697.266,9
D89426860 ± 32876,75349 ± 206179,99.3
E829831 ± 10091,51145,6 ± 29995,743.6
E3327446 ± 357276.12933,1 ± 69189.017.0
BW2003 wt229735 ± 23413 120662 ± 8971 0,4
D87434095 ± 667485.211126 ± 171090,84.5
E9347495 ± 141279.312002 ± 134890.14.2
E140135786 ± 2650040.962621 ± 327848.10,8

Concluzii

În lucrarea de față, este descrisă dezvoltarea pâinii de grâu potrivită pentru pacienții celiaci și alte patologii legate de gluten. Liniile de grâu cu conținut foarte scăzut de proteine ​​specifice glutenului (aproape fără gliadină) care sunt agenții cauzali pentru patologii precum boala celiacă au fost obținute de RNAi. Această pâine cu gliadină redusă are un conținut mai ridicat de lizină și o calitate similară pentru fabricarea pâinii cu pâinea normală și, prin urmare, ar putea contribui enorm la îmbunătățirea dietei acestor pacienți. Rezultatele raportate aici reprezintă un mare progres în dezvoltarea alimentelor sigure pentru persoanele din întreaga lume care suferă de patologii legate de gluten, cu proprietăți organoleptice excelente și o calitate nutrițională mai bună. Cu toate acestea, grâul transgenic este foarte reglementat și, în prezent, nu este cultivat comercial și acest lucru poate limita sau întârzia strategia propusă. Rezultatele prezentate aici indică faptul că făina și pâinea cu niveluri reduse ale acestor gliadine ar fi mai sigure pentru consumatorii intoleranți la gluten, deși valoarea acestui material depinde în continuare dacă poate sau nu să devină disponibilă comercial sau dacă aceste rezultate pot fi traduse în ceva care este disponibil comercial.

informatii justificative

Figura S1

Mostre de pâine. (A) Pâini de tip sălbatic BW208 și BW2003, linii cu gliadină redusă și orez; și (B) grafic de culoare care indică parametrii de culoare ai tipurilor sălbatice, transgenice medii (BW208 și BW2003) și orez. Valorile a *, b * și L * au fost obținute cu un colorimetru Chroma Meter CR-400 și sunt reprezentate ca o fracțiune din valoarea față de linia de tip sălbatic BW208.

Figura S2

Felii de pâine. (A) felii de tipuri sălbatice BW208 și BW2003, linii cu gliadină redusă și orez; și (B) grafic de culoare care indică parametrii de culoare ai tipurilor sălbatice, transgenice medii (BW208 și BW2003) și orez. Valorile a *, b * și L * sunt reprezentate așa cum este descris în Figura S1.

Figura S3

Microstructura de firimituri a probelor de pâine. Imagini SEM care arată microstructura firimitului de pâine în BW208 (A) de tip sălbatic și liniile cu gliadină redusă D894 (B) și E82 (C). Imaginile SEM au fost obținute la măriri de 1000x și 3000x. Barele de scalare sunt afișate în fiecare imagine.

Tabelul S1

Conținut de aminoacizi (%) din probe de făină proaspătă de tip sălbatic și linii cu gliadină scăzută.

Mulțumiri

Autorii îi mulțumesc prof. Peter Shewry (Rothamsted Research, Marea Britanie) și Jan Chojecki (PBL Technology, Marea Britanie) pentru comentarii critice asupra manuscrisului.

Declarație de finanțare

Ministerul spaniol al economiei și competitivității (proiectul AGL2010-19643-C02-02), Fondul european de dezvoltare regională (FEDER) și Junta de Andalucía (proiectul P09AGR-4783) au sprijinit această lucrare. Autorii recunosc, de asemenea, sprijinul financiar al Generalitat Valenciana (Proiect Prometeo 2012/064). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.