Microbiologie alimentară

Editat de
Baltasar Mayo

Consiliul Superior al Investițiilor Științifice (CSIC), Spania

Revizuite de
Anna Reale

Institutul de Științe Alimentare, Consiliul Național de Cercetare (CNR), Italia

Zhihong Soare

Laboratorul cheie de biotehnologie și inginerie lactate al Ministerului Educației, Universitatea Agricolă din Mongolia Interioară, China

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

profilarea

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • UMR GMPA, AgroParisTech, INRA, Université Paris-Saclay, Thiverval-Grignon, Franța

Introducere

În ultimii ani, mai multe studii au demonstrat fezabilitatea și beneficiile analizelor transcriptomice microbiene ale brânzeturilor (Lessard și colab., 2014; Dugat-Bony și colab., 2015; De Filippis și colab., 2016; Monnet și colab., 2016.; Duru și colab., 2018). Progresele tehnice recente și costul redus al tehnologiilor de secvențiere de mare viteză (HTS) permit acum cercetătorilor să capteze cu precizie transcriptomii a două sau mai multe specii prezente în același eșantion. Această abordare relativ nouă, cunoscută sub numele de ARN-seq dual, oferă o perspectivă mai completă pentru disecarea interacțiunilor interspecifice (Wolf și colab., 2018).

Scopul acestui studiu a fost de a investiga, printr-o combinație de analize microbiene, biochimice și transcriptomice, interacțiunile biotice în mini-brânzeturi la scară de laborator produse cu o cultură de maturare compusă din trei microorganisme: D. hansenii, a cărei funcție este de a crește pH-ul, Brevibacterium aurantiacum și Hafnia alvei. Ultimele două specii sunt capabile să producă compuși volatili de sulf (VSC) și sunt uneori asociați împreună în culturile comerciale utilizate pentru procesele de fabricare a brânzeturilor în care se dorește un nivel ridicat de producție a compușilor aromatici. B. aurantiacum este, de asemenea, utilizat frecvent în culturile de maturare pentru capacitatea sa de a produce pigmenți portocalii în brânzeturi.

Materiale și metode

Tulpini și condiții de creștere

Debaryomyces hansenii 304, B. aurantiacum 8 (6) și H. alvei GB001 provin din colecția de culturi GMPA (INRA, Thiverval-Grignon, Franța). Toate aceste tulpini au fost inițial izolate din brânzeturi. Drojdia D. hansenii a fost cultivat în bulion de dextroză de cartofi (BD Difco TM; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, Statele Unite), iar bacteriile au fost cultivate în bulion de infuzie cardiacă cerebrală (Biokar Diagnostics, Beauvais, Franța). Două culturi de succes au fost efectuate înainte de inocularea cașului de brânză. În prima cultură, tulpinile au fost crescute în condiții aerobe (agitator rotativ la 250 rpm) la 25 ° C în baloane conice de 50 ml conținând 10 ml mediu de creștere. După incubare timp de 48 h, un balon conic de 250 ml conținând 50 ml mediu corespunzător a fost inoculat cu 1 ml din cultura anterioară și incubat timp de 24 h în aceleași condiții.

Producție de mini-brânză la scară de laborator

Pentru a investiga interacțiunile biotice într-o cultură de maturare compusă din D. hansenii, B. aurantiacum, și H. alvei, am comparat diferite mini-brânzeturi care au fost produse cu comunitatea completă, cu D. hansenii singur, cu D. hansenii și H. alvei, si cu D. hansenii și B. aurantiacum, coapte la 15 ° C timp de 21 sau 28 de zile. În total, au fost investigate opt condiții biologice diferite (Tabelul 1). Combinațiile în care se omite drojdia nu au fost luate în considerare aici, deoarece nu s-a produs nicio creștere a bacteriilor din cauza acidității cașului de brânză (pH = 5,1). Patru replici de brânză (N = 4) au fost efectuate pentru fiecare stare biologică.

tabelul 1. Combinații de specii investigate în acest studiu.

Analize microbiene

Fiecare mini-brânză a fost amestecată cu o spatulă și 0,5 g de probă au fost apoi amestecate cu 9,5 ml de apă fiziologică (9 g/l NaCI). După omogenizare cu un blender Ultra-Turrax timp de 1 min la 20.500 rpm, s-au preparat diluții seriale de 10 ori în apă fiziologică și placate în duplicat pe plăci de agar. D. hansenii coloniile au fost numărate pe extract de drojdie-glucoză-cloramfenicol agar (Biokar Diagnostics) după 3 zile de incubație la 25 ° C. Coloniile de bacterii s-au numărat pe agar de infuzie cardiacă cerebrală (Biokar Diagnostics) suplimentat cu 50 mg/l de amfotericină (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Statele Unite), care inhibă creșterea ciupercilor, după 3 zile de incubare la 25 ° C. B. aurantiacum și H. alvei ar putea fi numărate diferențial pe acest mediu datorită culorii lor distincte a coloniilor. Creșterea microbiană a fost calculată ca medie aritmetică a tuturor replicilor biologice (N = 4), iar diferențele semnificative între condiții au fost evaluate de Student t-Test. Absența contaminării a fost verificată prin examinarea morfotipurilor coloniilor crescute pe plăci de agar.

Măsurarea pH-ului și evaluarea activităților proteolitice și lipolitice

Valorile pH-ului au fost măsurate pe mini-brânzeturi amestecate cu o spatulă. Activitatea proteolitică a fost determinată pe agar cazeinat de calciu modificat în conformitate cu Frazier și Rupp (Merck, Darmstadt, Germania) suplimentat cu 1% (g/v) lapte praf degresat (BD Difco TM). Activitatea lipolitică a fost determinată pe agar tributirină (Sigma-Aldrich) suplimentat cu 1% (greutate/volum) tributirină (Sigma-Aldrich). Zece microlitri de suspensii celulare la 106 CFU/ml în apă fiziologică (NaCI 9 g/l) au fost inoculate la fața locului pe plăci, care au fost apoi incubate la 15 sau 25 ° C timp de 21 de zile. Activitățile proteolitice și lipolitice au fost evaluate prin formarea unei zone clare în jurul petelor.

Extracția și analiza metabolitului prin UHPLC-MS și HPLC-UV

Toate brânzeturile au fost congelate la -20 ° C până la extracție. Procedura de extracție a metabolitului a fost adaptată de metoda descrisă anterior de Le Boucher și colab. (2013). Pe scurt, probele de brânză de aproximativ 2 g au fost diluate de 10 ori (g/g) în apă deionizată (Milli-Q Reagent Grade Water System, Millipore Corporation, Billerica, MA, Statele Unite). Amestecul a fost apoi omogenizat cu un blender Ultra-Turrax timp de 1 min la 20.500 rpm, iar omogenatul a fost centrifugat la 10.000 × g timp de 10 min la 4 ° C. Supernatantul a fost recuperat și centrifugat timp de 30 de minute la 8000 × g și 4 ° C pe unitățile de filtrare centrifugă cu o limită moleculară de 10 kDa (Vivaspin 20, Sartorius, Palaiseau, Franța).

Filtratul a fost apoi diluat în acid formic 1% pentru analize prin UHPLC-MS (UHPLC Ultimate 3000 și HR-MS-Q EXACTIVE, Thermo Fisher Scientific, Franța). Condițiile UHPLC au fost următoarele: metaboliții au fost separați pe o coloană fenilică Hypersil GOLD (lungime = 15 mm, diametru intern = 2,1 mm, dimensiunea particulelor = 3 μm; Thermo Fisher Scientific, Franța). Presiunea la începutul gradientului a fost de 120 bari și temperatura coloanei a fost de 25 ° C. Debitul a fost de 0,25 ml/min și solvenții au fost D: acetonitril (calitate HPLC) și B: apă ultra-pură + acid nonafluoropentanoic (3 mM). Gradientul de eluție a fost după cum urmează: 4 min la 98% B + 2% D, apoi 98% la 2% B în D timp de 6 min și, în cele din urmă, 2% B și 98% D timp de 3 min. Volumul injecției a fost de 5 μl și temperatura injectorului a fost de 7 ° C. Durata unei analize a fost de 14 min. Detectarea spectrometrică de masă a fost efectuată cu un quadrupol-orbitrap cu o sursă de electrospray operată în modul de ionizare pozitivă. Scanările complete au fost achiziționate cu un interval de scanare de 3,7 scanare/sec și un interval de masă de la 50 la 700 u.m.a. (unitate de masă atomică unificată) cu o rezoluție de 70.000. Datele au fost identificate și cuantificate utilizând software-ul TraceFinder (Thermo Fisher Scientific) conform soluției de calibrare.

Lactoza, acidul citric, galactoza, acidul lactic, glicerina, acidul acetic și etanolul au fost determinate prin HPLC (Waters S.A.S., Saint-Quentin, Franța). Separarea a fost efectuată pe o coloană Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 mm × 7,8 mm; Bio-Rad, Richmond, CA, Statele Unite), echipată cu o coloană cationică H1 Micro-Guard (30 mm × 4,6 mm; Bio- Rad) la un debit de eluent de 0,6 ml/min (pompă e2695; Waters SAS) și o temperatură de 35 ° C. S-a folosit H2SO4 5 mM ca eluant. Cuantificarea a fost efectuată utilizând un detector cu indice de refracție 410 (RI) și un detector 2489 UV/vizibil (Waters S.A.S.) la 210 nm, cu standarde externe (Sigma) de cantități cunoscute de substanțe pure comerciale preparate proaspete în apă filtrată, deionizată. Rezultatele au fost analizate de software-ul EmPOWER (Waters S.A.S.).

Extracția ARN-ului din probele de brânză, epuizarea ARN-ului și secvențierea ARN-ului

Cartografierea împotriva genomilor de referință

Citirile de secvențiere au fost mapate cu baza de date de referință adecvată utilizând alinierea de citire scurtă Bowtie versiunea 1.2.1.1 (Langmead și colab., 2009) cu următorii parametri: -a -m 1 –best –strata -v 2 -t -S. Au fost permise maximum două nepotriviri pentru fiecare citire a secvențierii. Bazele de date de referință au fost compuse din secvențele ADN codificatoare (CDS) ale tulpinilor care au fost inoculate în mini-brânzeturi, cu excepția D. hansenii, pentru care s-a făcut maparea pe genomul D. hansenii CBS767. Numerele de accesare NCBI BioProject ale tulpinilor utilizate pentru cartografiere sunt: ​​PRJEB19868 [B. aurantiacum 8 (6)], PRJEB6257H. alvei GB001) și PRJNA13832D. hansenii CBS767). Numărul de citiri care au fost mapate pe genomii de referință au fost numărate folosind HTSeq-count versiunea 0.10.0 (Anders și colab., 2015) cu următorii parametri: -s da -t CDS -i locus_tag -m union. Numai citirile mapate la secvențe unice au fost analizate în continuare.

Analize de date ARN-seq

Citirile secvențiale care au fost mapate la bazele de date CDS au fost extrase din setul de date brut. Datele au fost filtrate pentru a elimina genele care afișează în medie 1. Brut p-valorile au fost ajustate pentru testarea multiplă folosind procedura Benjamini-Hochberg (Benjamini și Hochberg, 1995), care evaluează rata de descoperire falsă. Transcrieri genice cu un ajustat p 3+/complexe siderofore prin membrana exterioară a bacteriilor gram-negative (Andrews și colab., 2003). A existat, de asemenea, o expresie mai mică a unei părți a genelor componente de tip ABC Fe 3+/siderofor, dar multe dintre aceste gene au avut un nivel de expresie scăzut, ceea ce explică de ce a fost observată doar o ușoară scădere a nivelului de expresie globală (citiri cumulate) . Proteina de stocare a fierului identificată în genomul H. alvei este bacterioferritina (CE 1.16.3.1), care este o proteină care conține hem. Exprimarea genei bacterioferritinei în H. alvei nu a fost modificat când a fost co-cultivat cu B. aurantiacum.

Figura 4. Exprimarea genelor implicate în achiziționarea fierului în mini-brânzeturi. Nivelul de expresie pentru fiecare tip de genă este reprezentat ca suma citirii secvențiale (normalizate față de fiecare specie) care a fost mapată la genele corespunzătoare. Barele sunt colorate în funcție de condițiile biologice; D21 și D28 corespund timpului de eșantionare (ziua 21, respectiv ziua 28); DH, HA și BA corespund prezenței D. hansenii, H. alvei, și B. aurantiacum, respectiv. Barele de eroare reprezintă abaterile standard (patru replici de brânză).

În D. hansenii, unele diferențe în nivelurile de expresie ale genelor implicate în achiziționarea fierului au fost observate în cele opt condiții biologice, dar nu s-a putut distinge un model comun (Tabelul suplimentar S15). Cu toate acestea, în ziua 28, a existat o scădere semnificativă a nivelului global de expresie a acestor gene (citiri cumulate) în mini-brânzeturile inoculate cu D. hansenii și H. alvei în comparație cu mini-brânzeturile inoculate numai D. hansenii (Figura 4).

Metabolismul sulfului

Discuţie

Tabelul 4. Posibile interacțiuni biotice între D. hansenii, H. alvei, și B. aurantiacum în mini-brânzeturi.

Rezultatele noastre sugerează că H. alvei ar putea beneficia de activitatea lipolitică a B. aurantiacum. Acest lucru a fost dedus din testul plăcii lipolitice, analiza genomică și analiza transcriptomică a mini-brânzeturilor. Într-adevăr, nu a fost detectată nicio activitate lipolitică pentru H. alvei pe agar tributirină și nu a fost identificată în genomul său nicio genă care codifică triacilglicerol lipaza secretă putativ. În prezența B. aurantiacum, a existat o puternică reglementare în sus a H. alvei gene implicate în catabolismul glicerinei, un substrat energetic derivat din lipoliza trigliceridelor. Putem astfel face ipoteza că creșterea H. alvei este favorizat de glicerolul eliberat din trigliceridele din brânză prin acțiunea triacilglicerol lipazei secretată de B. aurantiacum.

Datele transcriptomice au relevat că H. alvei a reprimat puternic expresia genelor metabolismului sulfului în B. aurantiacum, sugerând că prezența H. alvei disponibilitate crescută a aminoacizilor de sulf în B. aurantiacum. Acest lucru nu este ușor de explicat, deoarece nu a fost observată nicio activitate proteolitică H. alvei. Se poate presupune că, în absența H. alvei, slaba creștere a B. aurantiacum care a rezultat din disponibilitatea redusă de fier a limitat, de asemenea, cantitatea de proteaze secretată în brânză, ducând la o cantitate scăzută de aminoacizi liberi de sulf în brânză. Sunt necesare mai multe experimente pentru a confirma sau a invalida această ipoteză.

Prezentul studiu a indicat, de asemenea, că genele de catabolism D-galactonat ale B. aurantiacum și H. alvei sunt exprimate în timpul creșterii lor în brânză. Din câte știm, prezența D-galactonatului în brânzeturi nu a fost niciodată investigată până acum. Cu toate acestea, s-a emis ipoteza că, în unele soiuri de brânză, acest compus ar putea fi produs prin oxidarea lactozei reziduale sau galactozei și ulterior utilizat ca substrat de creștere de către unele microorganisme de brânză, cum ar fi Glutamycibacter arilaitensis (Monnet și colab., 2010). În studiul de față, am reușit să detectăm galactonatul în mini-brânzeturile noastre, ceea ce confirmă faptul că acest compus poate fi produs de unele microorganisme de brânză. Producerea de D-galactonat printr-o versatilă L-arabinoză dehidrogenază (AraDH) din Azospirillum brasilense a fost demonstrat într-un proiectat E coli tulpina (Liu și colab., 2014). Interesant este că genomul drojdiei D. hansenii codifică o supusă arabinoză dehidrogenază (eticheta locus DEHA2B12980g), care ar putea explica producția de galactonat în brânză de către acest microorganism.

Figura 7. Mecanisme propuse implicate în relația mutualistă dintre B. aurantiacum și H. alvei. Liniile verzi indică procesele prin care o specie și-ar putea stimula partenerul.