Abstract

Introducere

Hiperglicemia cauzată de acțiunea insuficientă a insulinei caracterizează diabetul de tip 2 (T2D). Rezistența la insulină și secreția de insulină defectă sunt cei doi factori patogeni majori ai bolii și ambii sunt puternic asociați cu stilul de viață și componentele genetice (1,2). Obezitatea este unul dintre factorii de risc puternici pentru dezvoltarea T2D. În obezitate, acumularea de lipide este frecventă nu numai în țesutul adipos, ci și în țesuturile ectopice, cum ar fi ficatul și mușchiul scheletic. Acumularea de lipide intracelulare în țesuturile ectopice duce la deteriorarea semnalizării insulinei și promovează rezistența sistemică la insulină (3). Cu toate acestea, nu toți indivizii obezi dezvoltă T2D deoarece celulele β pancreatice se pot ajusta, într-o anumită măsură, pentru o cerere crescută de insulină. Disfuncția pancreatică a celulelor β este centrală în eșecul ajustării pentru rezistența crescută la insulină. Într-adevăr, răspunsul redus la insulină în prima fază poate fi observat, cel puțin la unii indivizi, deja înainte de dezvoltarea T2D (4). Aceste descoperiri sugerează că cei care nu se pot adapta la cererea suplimentară prin creșterea secreției de insulină sunt predispuși la T2D.

potențială

La fel ca țesuturile țintă ale insulinei, celulele β producătoare de insulină s-au dovedit a fi deteriorate de acumularea excesivă de lipide, un concept cunoscut sub numele de lipotoxicitate a celulelor β (5). În această afecțiune, lipidele acumulate, în special triacilglicerolul, provoacă stres celular, disfuncții și moartea celulei β. De fapt, s-a observat o acumulare crescută de picături lipidice cu IMC crescut în celulele β umane (6). O serie de studii in vitro au identificat mecanisme implicate în afectarea secreției de insulină prin creșterea acidului gras cronic (FA) (7,8), inclusiv cele care afectează exocitoza (9). Mai mult, semnalizarea insulinei în celulele β este esențială nu numai pentru creștere, ci și pentru reglarea corectă a funcției celulare (10-12). Prin urmare, împreună aceste descoperiri indică faptul că rezistența la insulină și secreția de insulină defectă sunt susceptibile de a împărtăși etiologii comune în ceea ce privește acumularea de lipide. Atât sinteza endogenă a FA, cât și absorbția FA sunt considerate ca fiind importante pentru creșterea acumulării de lipide în celulele β (13,14).

Arătăm în acest studiu că, printre donatorii umani cu obezitate, capacitatea de secreție de insulină a insulelor pancreatice și exocitoza celulelor β au fost semnificativ mai mici la donatorii cu T2D decât în ​​non-T2D (ND). Am comparat nivelurile de expresie ale transportorilor FA în insulele lor pentru a aborda rolul facilitării absorbției FA pentru secreția de insulină defectă. Am explorat în detaliu calea de semnalizare implicată în secreția de insulină modulată CD36 în celulele β utilizând celule INS-1 care poartă un sistem Tet-on pentru supraexprimarea CD36. În cele din urmă, am testat potențialul terapeutic al unui anticorp neutralizant CD36 pentru a îmbunătăți funcția celulelor β în celulele EndoC-βH1 umane.

Proiectare și metode de cercetare

Linia celulară și cultura

Celulele INS-1 care transportă sistemul Tet-on pentru supraexpresia CD36 (15) au fost cultivate cu mediu RPMI 1640 conținând 11,1 mmol/L glucoză, 10% FBS, 100 UI/mL penicilină, 100 μg/mL streptomicină, 50 mg/mL neomicină, 50 mg/mL higromicină, 10 mmol/L HEPES, 1 mmol/L piruvat de sodiu și 50 μmol/L β-mercaptoetanol la 37 ° C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. Pentru a induce expresia CD36, celulele au fost însămânțate în plăci cu 24 sau 48 de godeuri și cultivate cu sau fără doxiciclină de 500 ng/ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) timp de 72 de ore.

Celulele EndoC-βH1 (16) au fost cultivate în vase acoperite cu Matrigel/fibronectină (respectiv 100 μg/ml și respectiv 2 μg/ml) (Sigma-Aldrich) cu DMEM conținând 5,6 mmol/L glucoză, 2% BSA, 10 mmol/L nicotinamidă, 50 μmol/L β-mercaptoetanol, 5,5 μg/mL transferrin, 6,7 ng/mL selenit de sodiu, 100 UI/mL penicilină și 100 μg/mL streptomicină la 37 ° C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. Celulele au fost însămânțate în plăci cu 48 de godeuri acoperite cu Matrigel/fibronectină și cultivate timp de 72 ore cu 2 μg/ml de anticorp blocant CD36 (FA6.125, număr de catalog 60084; STEMCELL Technologies, Vancouver, British Columbia, Canada) sau un controlul izotipului (MOPC-21, număr de catalog ab18443; Abcam, Cambridge, Marea Britanie).

Insulele pancreatice umane

Insulele pancreatice umane au fost obținute de la donatori de cadavre de origine europeană de către Rețeaua nordică pentru transplantul de insule clinice. Insulele au fost procesate așa cum s-a descris anterior (17) și selectate manual sub stereomicroscop înainte de utilizare. Pentru a se disocia în celule unice, insulele au fost incubate cu 3 mmol/L EGTA în soluție de sare echilibrată a Hanks conținând 0,25% BSA timp de 15 minute la 37 ° C urmată de pipetare ușoară. Caracteristicile donatorului pentru fiecare experiment sunt prezentate în tabelul suplimentar 1. Toate procedurile care utilizează insulele umane au fost aprobate de comitetele etice din Uppsala și Malmö/Lund, Suedia.

Analiza datelor de secvențiere a ARN-ului insulei umane

Datele de secvențiere a ARN-ului insulinei (ARN-seq) au fost extrase din Genn Expression Omnibus cu numerele de acces GSE50398 și GSE108072 din studiile lui Fadista și colab. (18) și Gandasi și colab. (19), respectiv. Valorile expresiei sunt exprimate ca numărare log2 la milion după normalizare și transformare folosind voom. Nivelurile de expresie ale genelor selectate au fost preluate de la 68 de donatori cu greutate corporală normală (IMC 2) și 31 de donatori obezi (IMC ≥30 kg/m 2).

Analiza secreției de insulină

Pentru celulele CD36 INS-1, după ce au fost spălate de două ori cu 1 ml tampon de testare a secreției preîncălzite (SAB) (1,16 mmol/L MgSO4, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L KH2PO4, 114 mmol/L NaCl, 2,5 mmol/L CaCl2, 25,5 mmol/L NaHCO3, 20 mmol/L HEPES și 0,2% BSA, pH 7,2) cu 2,8 mmol/L glucoză, celulele au fost preincubate în 0,5 ml SAB cu 2,8 mmol/L glucoză timp de 1 oră. Celulele au fost apoi stimulate timp de 1 oră în 0,25 ml SAB cu 2,8 mmol/L glucoză sau 16,7 mmol/L glucoză sau timp de 15 minute în 0,25 ml SAB cu 2,8 mmol/L glucoză și 50 mmol/L KCl la 37 ° C. Nivelurile secretate de insulină au fost măsurate folosind ELISA de insulină de șobolan (Mercodia, Uppsala, Suedia), iar valorile au fost normalizate la conținutul de proteine. Proteina a fost extrasă cu 100 μL tampon RIPA (0,1% SDS, 150 nmol/L NaCl, 1% Triton X-100 și 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8,0), iar conținutul a fost analizat folosind un kit de testare a proteinei BCA (Thermo Fisher Scientific).

Pentru celulele EndoC-βH1, mediul de cultură a fost schimbat într-un mediu care conține 2,8 mmol/L glucoză și incubat în continuare timp de 18 ore înainte de testarea secreției. După două spălări cu 1 ml SAB conținând 1 mmol/L glucoză, celulele au fost preincubate în 0,5 ml SAB cu 1 mmol/L glucoză timp de 2 ore. Celulele au fost apoi stimulate timp de 15 minute cu 0,25 ml SAB cu 1 mmol/L glucoză sau 20 mmol/L glucoză la 37 ° C. Nivelurile de insulină secretate au fost măsurate utilizând insulina umană ELISA (Mercodia), iar valorile au fost normalizate la conținutul de proteine. Conținutul de proteine ​​a fost măsurat ca mai sus.

Pentru insulele umane, secreția de insulină stimulată de glucoză a fost examinată utilizând un sistem dinamic de perifuzie a glucozei pentru a calcula indicele de stimulare ca control al calității (20). Pentru a evalua secreția de insulină indusă de depolarizarea membranei, loturi de 12 insule au fost preincubate timp de 30 de minute în tampon bicarbonat Krebs-Ringer, pH 7,4, suplimentat cu 20 mmol/L HEPES, 0,1% BSA și 1 mmol/L glucoză și apoi stimulate pentru 1 h în tampon bicarbonat Krebs-Ringer cu 70 mmol/L KCl și 1 mmol/L glucoză.

Testul de stimulare a insulinei

Testul de stimulare a insulinei a fost efectuat pe celulele confluente după 72 de ore de însămânțare. După spălare cu PBS preîncălzit de două ori, celulele au fost precondiționate cu mediu de cultură fără FBS conținând 1 mmol/L glucoză timp de 6 ore pentru a diminua un efect autocrin al insulinei pe calea de semnalizare. Celulele au fost apoi stimulate timp de 10 minute în mediul de condiționare fără (0) sau cu 1 sau 10 nmol/L insulină umană (Actrapid Penfill; Novo Nordisk, Bagsværd, Danemarca). După aruncarea mediului, celulele au fost înghețate imediat în azot lichid și lizate cu un tampon de încărcare o singură dată, urmat de sonicare. Lizatele celulare au fost depozitate la -80 ° C până la analiza Western blot.

Fracționarea subcelulară

Fracționarea subcelulară a celulelor CD36 INS-1 a fost realizată folosind un kit de fracționare a proteinei subcelulare pentru celulele cultivate (Thermo Fisher Scientific). Puritatea fiecărei fracții a fost verificată prin analiza Western blot.

Analiza Western Blot

Electrofiziologie

Experimentele cu patch-clamp cu celule întregi au fost efectuate pe celule β umane unice (capacitate celulară> 9 pF) sau celule CD36 INS-1 așa cum s-a descris anterior (21). Înregistrările au fost efectuate folosind un amplificator EPC 10 patch-clamp cu software Patchmaster (ver. 2–73; HEKA Elektronik, Lambrecht, Germania). Exocitoza a fost evocată de un tren de 10 500-ms despolarizări de la -70 la 0 mV aplicat la 1 Hz. Curenții dependenți de tensiune au fost investigați utilizând un protocol de tensiune curent în care membrana a fost depolarizată de la -70 mV la tensiuni cuprinse între -40 și +40 mV pe parcursul a 50 ms. Curentul susținut (I), măsurat în ultimii 20 ms ai depolarizărilor, a fost considerat ca un curent de Ca 2+.

Imunocitochimie

Celulele insulei disociate sau celulele CD36 INS-1 au fost fixate și colorate așa cum s-a descris în altă parte (22). Anticorpi primari pentru CD36 (JC63.1, număr de catalog ab23680, 1: 200; Abcam), insulină (număr de catalog 03–16049; 1: 400; American Research Products, Inc., Waltham, MA), catalog Na + K + ATPase numărul ab76020; 1: 200; Abcam) și FoxO1 (numărul de catalog 2880; 1: 200; Tehnologie de semnalizare celulară) diluate în tampon de blocare au fost tratate timp de 2 ore. După spălarea de două ori cu PBS, celulele au fost expuse la anticorpi secundari corespunzători marcați fluorescent (1: 400) timp de 1 oră, urmată de postfixare cu paraformaldehidă 3% în PBS. Imunofluorescența a fost observată cu un microscop confocal (Meta 510 sau LSM 880; Carl Zeiss, Oberkochen, Germania). Localizarea nucleară a FoxO1 a fost evaluată prin intensitatea fluorescenței nucleare normalizată la intensitatea celulei întregi. Regiunea nucleară a fost definită prin colorarea DAPI. Intensitatea fluorescenței a fost analizată cu software-ul ZEN (Carl Zeiss).

Citometrie în flux

Celulele insulelor disociate au fost colorate cu aloficocianină (APC) -conjugată anti-CD36 (numărul de catalog 562744; BD Biosciences) timp de 30 de minute în PBS cu 0,5% BSA și 0,05% azidă de sodiu. Celulele au fost apoi fixate cu paraformaldehidă 3,7% în PBS timp de 20 de minute și colorate ulterior intracelular cu Alexa Fluor 488 - anti-insulină conjugată (număr de catalog IC1417A; sisteme R&D) și anti-glucagon conjugat cu ficoeritrina (număr de catalog 565860; BD Biosciences) timp de 30 min în 0,1% saponină în PBS cu 0,5% BSA și 0,05% azidă de sodiu. După ce celulele au fost postfixate cu paraformaldehidă 1%, analiza citometrică de flux a fost efectuată folosind un citometru de flux CytoFLEX (Beckman Coulter, Brea, CA) cu software-ul CytExpert (versiunea 2.0; Beckman Coulter).

Extracția ARN, RT-PCR și PCR cantitativă

ARN total din celulele CD36 INS-1 a fost extras și ADNc a fost generat așa cum este descris (23). PCR cantitativă a fost efectuată în plăci de 384 de godeuri pe un sistem de PCR în timp real ViiA 7 (Thermo Fisher Scientific) utilizând teste de expresie genică TaqMan cu Master PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Șobolan Hprt1 (număr de identificare a testului: Rn01527840_m1; Applied Biosystems) și Ppia (număr de identificare a testului: Rn00690933_m1) au fost utilizate pentru normalizare. Expresia relativă a fost calculată utilizând metoda ciclului de prag ΔΔ.

Microscopie electronică de transmisie

Celulele CD36 INS-1 și EndoC-βH1 au fost preparate pentru microscopie electronică, examinate și analizate așa cum s-a descris anterior (24). Granulele (vezicule mari cu miez dens) au fost definite ca ancorate atunci când centrul granulei a fost situat la 100 nm și 120 nm de la membrana plasmatică pentru CD36 INS-1 și, respectiv, EndoC-βH1. Distanța dintre centrul granulei și membrana plasmatică a fost calculată utilizând un software intern programat în MATLAB 7 (The MathWorks, Inc., Natick, MA).

Analize statistice

Datele sunt prezentate ca medie ± SE. Diferențele dintre cele două grupuri au fost analizate prin testul Student t cu analiză cu două cozi. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind Prism (versiunea 7.0; GraphPad Software, San Diego, CA).

Disponibilitatea datelor și a resurselor

Seturile de date generate și/sau analizate în timpul studiului actual sunt disponibile de la autorii relevanți, la cerere rezonabilă. Linia de celule INS-1 care supraexprimă CD36 poate fi disponibilă de la Prof. Anneli Björklund (Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia) la cerere rezonabilă și cu permisiunea fondatorului, C.B.W.

Rezultate

Secreția redusă a insulinei insulinei și exocitoza celulelor β la donatorii cu T2D și obezitate

Am investigat capacitatea de secreție de insulină a insulelor pancreatice la donatorii cu T2D și ND cu greutate corporală normală (IMC 2) sau obezitate (IMC ≥30 kg/m 2). Insulele donatorilor cu T2D în ambele categorii IMC au prezentat secreție redusă de insulină stimulată de glucoză în comparație cu cele ale ND (Fig. 1A și B). Secreția bazală de insulină a scăzut numai în insulele donatorilor cu T2D cu greutate corporală normală (Fig. 1A). În consecință, scăderea indicelui de stimulare a insulinei în insulele T2D a fost confirmată numai în rândul donatorilor cu obezitate (Fig. 1 suplimentară). Incubația statică cu K + a relevat, de asemenea, scăderea semnificativă a secreției de insulină în insulele T2D în comparație cu ND în rândul donatorilor cu obezitate, deși o secreție similară de insulină bazală (Fig. 1C și D), sugerând defecte în aval de canalul K + dependent de ATP. Într-adevăr, înregistrările de capacitate pe celule β unice evocate de un tren de 10 500-ms depolarizări de la -70 la 0 mV au demonstrat o exocitoză dependentă de Ca 2+ în celulele β ale donatorilor obezi cu T2D în comparație cu cele ale donatorilor obezi cu ND (Fig. 1E).

Model care descrie posibila implicare a CD36 în andocarea granulelor β și exocitoza. Facilitarea mediată de CD36 a influxului de lipide (inclusiv FA) crește DAG intracelular, ceea ce duce la translocarea nPKC-urilor către membrana plasmatică (activarea nPKC-urilor). NPKC-urile activate determină fosforilarea anormală a IRS1 și, în consecință, atenuează semnalizarea PI3K/AKT. Următoarea retenție a FoxO1 în nucleu are ca rezultat inhibarea transcripțională a Irs2 și a genelor exocitotice, care la rândul lor afectează andocarea și amorsarea granulelor cu exocitoza afectată a granulelor de insulină și secreția redusă de insulină în celulele β ca o consecință. β-Ox, β-oxidare; InsR, receptor de insulină; TAG, triacilglicerol.

Importanța semnalizării insulinei pentru funcția celulelor β, în special în secreția de insulină în faza incipientă, a fost demonstrată anterior la șoarecii cu deficit de receptor de insulină specifică celulei β (51). Cu toate acestea, o moleculă cheie responsabilă de modularea semnalizării insulinei β-celulare în T2D nu a fost investigată anterior. În mod curios, mecanismul propus pentru suprimarea semnalizării insulinei β-celulare de către CD36 este considerat similar cu alte organe țintă pentru insulină (15,52), dar rezultatele sunt unice pentru celulele β (adică exocitoza defectă și secreția redusă de insulină în prima fază) . Prin urmare, CD36 poate fi un numitor comun care leagă cele două etiologii majore ale T2D (adică rezistența la insulină și secreția de insulină defectă). Luate împreună, descoperirile noastre evidențiază în continuare rolul patogen al CD36 cu celule β în dezvoltarea T2D, în special în legătură cu obezitatea.

Informații despre articol

Mulțumiri. Autorii îi mulțumesc Anna-Maria Veljanovska Ramsay și Britt-Marie Nilsson (ambii de la Centrul de diabet al Universității Lund, Malmö, Suedia), precum și lui Momoyo Kawahara și Miyuki Takatori (ambii de la Nippon Medical School, Tokyo, Japonia) pentru asistență tehnică. Autorii îi mulțumesc, de asemenea, lui Anneli Björklund (Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia) pentru furnizarea liniei de celule INS-1 supraexprimate CD36 și EXODIAB și Rețelei nordice pentru transplantul de insule clinice pentru furnizarea de insule umane și date despre insule umane.

Finanțarea. Acest studiu este susținut financiar de Fundația suedeză pentru cercetare strategică (IRC15-0067 către Centrul de cercetare industrială al Universității din Lund), Consiliul suedez de cercetare (2009-1039 către EXODIAB; 349-2006-237 către Centrul de diabet al Universității din Lund; și proiectul subvenții 2016-02124 și 2019-01406 către LE), Societatea japoneză pentru promovarea științei (către MN, JLSE și AA), Fundația Europeană pentru Studiul Diabetului și Japonia Diabetes Society (către MN), Insamlingsstiftelsen Diabetes Wellness Network Sverige (720-2964 JDWG către MN), Uehara Memorial Foundation (către MN), Scandinavia-Japan Sasakawa Foundation (către MN), Sumitomo Life Welfare Foundation (către MN), Nippon Medical School Alumni Association (către MN), Premiul Lotte Shigemitsu ( către AA), Fundația Albert Påhlsson (către JLSE și LE), Regiunea Skåne-subvenție regională (ALF) (către LE), Fundația Novo Nordisk (către LE) și Fundația Suedeză pentru Diabet (DIA2016-130 la LE).

Dualitatea interesului. Nu au fost raportate potențiale conflicte de interese relevante pentru acest articol.