Informații despre articol

Laborator de bază pentru colaborare în cercetarea medicinii translaționale, Centrul Sir James Black, Dow Street, Universitatea din Dundee, DD1 5EH, Marea Britanie Tel: 44 (0) 1382 386 349; Fax: 44 (0) 1382 386 419; Email: [email protected] sau [email protected] * Autorii au contribuit în mod egal la această lucrare.

liniar

Abstract

Introducere

Dezvoltarea biomarkerilor de înaltă calitate pentru progresia bolii, implicarea țintă, efectele farmacodinamice și eficacitatea compusului este esențială pentru eforturile de cercetare translațională care vizează stabilirea unei medicamente personalizate. Cu toate acestea, identificarea acestor biomarkeri este frecvent îngreunată de lipsa accesului la țesuturile țintă cu implicare biologică directă. Ca atare, sângele periferic (PB) a devenit o sursă din ce în ce mai atractivă de material surogat în locul țesutului țintă, ca obiectiv pentru descoperirea și aplicarea biomarkerilor, reprezentând una dintre cele mai disponibile și practice surse de material biologic colectat în cadrul clinicii și care permite o metodă în mare parte neinvazivă de analize repetate în cadrul aceluiași pacient (Burczynski și Dorner, 2006).

Profilarea transcripțională din PB poate fi realizată utilizând o serie de metodologii și fluxuri de lucru asociate; de exemplu a) sânge integral, b) fracțiuni mononucleare îmbogățite (PBMC) sau c) linii hematopoietice specifice selectate/îmbogățite. Bineînțeles, fiecare dintre aceste abordări posedă avantaje și dezavantaje distincte. Reprezentarea descendenței hematopoietice în PBMC-uri sau fracțiuni selectate/îmbogățite, deși nu necesită introducerea strategiilor de reducere a globinei înainte de experimentele cu microarray, este limitată în mod natural la liniile studiate și, prin urmare, mai multe linii celulare sunt omise din analize ulterioare. Profilarea globală a ARN-ului din sânge integral, deși este de preferat pentru a capta transcriptomul de sânge în întregime, a solicitat în mod tradițional strategii de reducere a globinei înainte de generarea sondei pentru analiza microarrayului, pentru a reduce interferența transcrierilor de globină cu sondele matrice. În plus față de creșterea etapelor de procesare, aceste proceduri adaugă riscul modulației artefactual a transcriptomului și utilitatea strategiilor de reducere a globinei au fost puse la îndoială în mai multe rapoarte (Liu și colab. 2006; Li și colab. 2008; Dumeaux și colab. 2008).

Consistența datelor de profilare a expresiei genice a sângelui integral depinde în mare măsură de metoda de stabilizare a probei utilizată la flebotomie sau în timpul depozitării (Debey și colab. 2006; Rainen și colab. 2002). Există tehnologii pentru colectarea și stocarea probelor de sânge integral, concepute pentru a depăși problemele asociate cu colectarea clinică și stabilitatea transcriptomului PB. Unul dintre acestea, sistemul de ARN din sânge PAXgene ™ (PreAnalytiX, Hornbrechtikon, Elveția) constă dintr-un tub de ARN PAXgene ™ evacuat pentru colectarea sângelui și un kit de procesare pentru izolarea ARN-ului total din sângele integral. Tubul de colectare PAXgene ™ conține un reactiv propriu despre care se raportează că stabilizează imediat ARN-ul intracelular până la 3 zile la temperatura camerei. Potențialul de a minimiza cerința pentru prelucrarea urgentă a probelor prin creșterea stabilității clinice a transcriptomului probei în această matrice este esențial pentru descoperirea biomarkerilor robusti.

Prin urmare, în studiul de față am căutat să identificăm un flux de lucru care să permită potențial (a) stabilizarea eficientă și imediată a sângelui integral periferic colectat și (b) generarea de sonde de microarrays fără necesitatea reducerii globinei. În plus față de stabilirea robusteții și reproductibilității unor astfel de metode, am măsurat și reprezentarea transcriptomilor genealogici hematopoietici specifici oferite de abordările evaluate pentru a identifica un flux de lucru optim.

Materiale și metode

Colectarea și prelucrarea probelor

Probele de sânge au fost colectate de la un donator sănătos autorizat în mod corespunzător folosind sistemul de tuburi de colectare PAXgene ™ (PreAnalytiX, Hornbrechtikon, Elveția). Sângele a fost extras prin proceduri standard de flebotomie, cu 2,5 ml distribuite în fiecare dintre cele 6 tuburi PAXgene ™ și prelucrate în conformitate cu instrucțiunile producătorului (Fig. 1). Pe scurt, jumătate din probele recoltate (n = 3) au fost menținute la temperatura camerei timp de 2 ore și cealaltă jumătate timp de 24 de ore, ambele în perioada stabilită de producător de 2-72 ore. Toate probele au fost inversate de 10 ori și congelate la –20 ° C peste noapte și apoi mutate la –80 ° C pentru depozitare până la izolarea ARN (Experimentul 1). Aceeași procedură experimentală a fost repetată folosind o extragere de sânge proaspătă obținută de la același donator într-o zi separată (Experimentul 2).

Figura 1 Fluxul de lucru al experimentului utilizat pentru stocarea și prelucrarea sângelui integral colectat PAXgene ™. Sângele integral periferic a fost colectat de la un singur donator în fiecare din cele două zile separate (Experimentele 1 și 2). 2,5 ml sânge integral a fost distribuit în fiecare din cele 6 tuburi PAXgene ™ pentru fiecare experiment. După inversare (de 10 ori), tuburile au fost depozitate la temperatura camerei timp de 2 ore sau 24 ore. Toate probele au fost apoi transferate la –20 ° C peste noapte, urmate de –80 ° C pentru depozitare până când procedurile de izolare a ARN-ului au fost efectuate folosind kitul de izolare a ARN-ului PAXgene ™. Sondele sscDNA au fost sintetizate prin amplificare SPIA NuGEN Whole Blood folosind amplificarea V2 NuGEN Ovation ™ ARN și sistemul reactiv al sângelui integral. ADNscsc a fost apoi hibridizat cu matricile Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0. WB –– Sânge întreg, HG = genom uman, PAX ’= PAXgene ™ și RT = temperatura camerei.

Probele de sânge suplimentare de la același subiect au fost colectate în tuburi K3-EDTA și prelucrate pentru analiza totală a sângelui pe un analizor Sysmex XE 2100 complet automatizat al numărului total de sânge.

Izolarea totală a ARN-ului

Linii de celule hematopoietice

Datele de expresie a transcrierii liniei celulare hematopoietice au fost obținute din mai multe surse (vezi Tabelul 4). ARN derivat intern (celule B, celule T și celule dendritice) pentru hibridizarea microarray a fost obținut din preparate de celule congelate achiziționate de la Lonza Biosciences (Basel, Elveția). Datele de expresie a transcrierii pentru o gamă largă de alte linii celulare au fost obținute din seturi de date publice depuse în Genn Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), numere de acces GSE1133 și GSE3982 (Jeffrey și colab. 2006; Su și colab. 2004). Luat împreună acest set de date a furnizat o sursă de date de expresie a ARNm (derivate din Affymetrix GeneChips () dintr-o gamă largă de linii de celule hematopoietice pregătite fie prin gradient de densitate, izolarea paramagnetică a mărgelei pozitive sau negative, și cu sau fără diferențierea stimulată in vitro.

Tabelul 1 Randament și metrici de calitate pentru ARN total izolat și sonde de ADNc monocatenare sintetizate.